- Abertura da fita de DNA que servirá de molde, por desnaturação térmica (etapa com duração entre 30s e 1min a temperatura de 92-96ºC);

- Pareamento de oligonucleotídeos sintéticos, que funcionam como os iniciadores da reação de polimerização, a cada uma das fitas do DNA molde, à região complementar da fita que sofrerá a duplicação (duração de 30s a 1min a temperatura entre 58 e 65ºC);

- Polimerização, através de uma enzima polimerase, das novas fitas de DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando cada um dos quatro dNTP como substrato da reação de polimerização (duração entre 45s e 1min, a 72ºc).

A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) é uma variação da técnica de PCR, a qual permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente. O resultado é visualizado em Tempo Real durante a amplificação da sequência de interesse, com capacidade ainda de gerar resultados quantitativos com maior precisão.

Durante a amplificação, a quantificação é determinada pela quantidade de produto amplificado durante cada ciclo, através da fluorescência emitida. Esta metodologia utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emissão da fluorescência.

·    Ciência forense– para comparar o DNA encontrado no local do crime com o de possíveis suspeitos.

·    Genética– teste de paternidade, diferenciação de espécies ou linhagens e engenharia genética.

·    Microbiologia– detecção de diferentes patógenos como vírus, bactérias e fungos.

·    Bioquímica– detecção da expressão de proteínas.

A técnica consiste na migração de moléculas em função da aplicação de um campo elétrico.

A princípio a mostra é aplicada em gel e a fonte de eletroforese cria a corrente elétrica que ocasiona a sua migração, quanto maior a molécula, mais lento é este processo, assim, moléculas de diferentes tamanhos realizam este trajeto de um pólo a outro em tempo e velocidades distintos.

A distância que o fragmento percorreu é comparada a um padrão e as bandas irão guiar o pesquisador durante a análise. Para a visualização, é utilizado um corante que sob a luz UV de um transiluminador emite fluorescência e permite a leitura das bandas.

O fluxo migratório é determinado pelo peso molecular, na qual moléculas de menor peso migram mais rápido que as de maior peso, formando as bandas características que serão visualizadas posteriormente.

Em uma extremidade, o gel tem cavidades semelhantes a bolsos chamadas poços, onde as amostras de DNA serão colocadas.
Antes das amostras de DNA serem adicionadas, o gel deve ser colocado em uma caixa de gel. Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo positivo, enquanto a outra extremidade é ligada a um eletrodo negativo. O corpo principal da caixa, onde o gel é colocado, é preenchido com uma solução tampão contendo sal que pode conduzir corrente.

 

O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.

 

Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.

 

Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C.


O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até que o nível desejado de amplificação seja obtido.

Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase.

Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura específica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o número de ciclos de replicação.

A detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose, que é corado com brometo de etídio, permitindo a visualização direta do DNA pesquisado. Hoje, existem termocicladores que, além de amplificar o DNA, permitem a sua detecção – chamada PCR em tempo real (qPCR).

Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externo para a 1^a reação e outro interno ao produto da 1^a reação. A 1^a reação necessita de um maior tempo de extensão devido ao maior tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota da 1^a reação, que servirá de molde na mistura da 1^a reação. O produto da 1^a reação normalmente não é notado em corrida em gel de agarose. Por outro lado, o produto da 2^a reação gerado em grande quantidade o é, por isso pode ser visualizado na corrida eletroforética ou utilizado para sequenciamento

A reação de PCR é ativada quando a temperatura atinge 96⁰C. Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir esta temperatura. DNA polimerases que não possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejados (inespecíficos) em temperatura ambiente.

Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa à
70 °\text C70°C
70, °, start text, C, end text (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas. 


Primers de PCR

Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher.

Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta de 
2020
20 aminoácidos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares.

A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) é uma variação da técnica de PCR, a qual permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente. O resultado é visualizado em Tempo Real durante a amplificação da sequência de interesse, com capacidade ainda de gerar resultados quantitativos com maior precisão.

Durante a amplificação, a quantificação é determinada pela quantidade de produto amplificado durante cada ciclo, através da fluorescência emitida. Esta metodologia utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emissão da fluorescência.

Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA

Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externo para a 1^a reação e outro interno ao produto da 1^a reação. A 1^a reação necessita de um maior tempo de extensão devido ao maior tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota da 1^a reação, que servirá de molde na mistura da 1^a reação. O produto da 1^a reação normalmente não é notado em corrida em gel de agarose. Por outro lado, o produto da 2^a reação gerado em grande quantidade o é, por isso pode ser visualizado na corrida eletroforética ou utilizado para sequenciamento.^{School of Public Health University of California Eva Harris Faculty, Berkeley}

A reação de PCR é ativada quando a temperatura atinge 96⁰C. Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir esta temperatura. DNA polimerases que não possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejados (inespecíficos) em temperatura ambiente.

- Pareamento de oligonucleotídeos sintéticos, que funcionam como os iniciadores da reação de polimerização, a cada uma das fitas do DNA molde, à região complementar da fita que sofrerá a duplicação (duração de 30s a 1min a temperatura entre 58 e 65ºC);

- Polimerização, através de uma enzima polimerase, das novas fitas de DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando cada um dos quatro dNTP como substrato da reação de polimerização (duração entre 45s e 1min, a 72ºc).