K한방연구소 : AAB로 만든 냉차가 암세포의 성장을 억제한다.

S대학교 : AAA와의 comparative genomics를 통해 AAB에 특이적으로 존재하는 눈여겨 볼만한 후보 유전자 X를 찾았다.

SS바이오 : 후보 유전자 X의 protein 발현 및 순수 분리 및 정제에 성공했다.

=> 후보 유전자 X가 X peptide를 만들어내고, X peptide는 Anti-Cancer Peptide(ACP)일 것이라 예상

protein: 50개 이상의 아미노산이 나열돼 있으며, 4차 구조를 형성한 것으로,

여러가지 역할을 수행

-> X protein: X gene으로부터 생성된 전체 단백질

peptide: 50개 이하의 아미노산으로 구성돼 있는 짧은 서열, protein의 기능을 담당하는 부분

-> Xq peptide: X gene이 생성해낸 X protein 중 항암 효과가 있는 일부분

tag에는 여러 종류가 있지만

보통 길이가 짧아서 클로닝하기 편한 his-tag를 많이 씀

Xq peptide 선정

Docking 분석

In vitro 실험

• CCK-8 assay

In vivo 실험

• 선행 연구

• H&E염색, Caspase-3 활성화 분석

MTT assay

살아있는 세포의 효소가 수용성 MTT염료를 불용성의 포르마잔 결정으로 환원 시키는 원리 이용함. 포르마잔 결정은 용해 과정을 거친 후 흡광도를 측정해 세포 생존율을 확인함. 포르마잔을 용해하기 위해 DMSO 같은 유기 용매를 추가해야 하기에 독성이 가해질 수 있다는 단점이 존재함.

CCK-8 assay

살아있는 세포의 효소가 WST-8 염료를 가용성의 포르마잔으로 변환함. CCK-8은 수용성의 포르마잔을 생성하기에 따로 용매가 필요하지 않고 반응 끝난 직후에 바로 흡광도를 측정할 수 있음.

선행 연구

식물 유래 항암 peptide/단백질 내 세포 내 delivery system과 동물 실험을 위한 standard protocol (1단계, '20~'22) + H&E 염색, Caspase-3 활성화 분석 함께 진행

종류:

1. 작은 화학물질 들의 결합에 의한 protein의 변형: 인산화 (phosphorylation), 아세틸화 (acetylation), 메틸화 (methylation)

2. 비교적 큰 분자들의 결합에 의한 변형: 당화 (glycosylation), 지방산화 (예, prenylation), 핵산화 (예, adenylation)

3. protein의 절단(limited proteolysis)에 의한 변형

4. 작은 protein(예, 유비퀴틴, SUMO 등)의 결합에 의한 protein의 변형

-> protein의 종류를 극대화시키고 세포 내에서 그들의 활성, 위치, 다른 분자와의 결합 등을 조절함으로써, 생체 내의 모든 생리적 기능을 제어함.

Xq peptide 아미노산 서열

LLISLLF

Xq gene 서열

ctcctcatctctcttctcttc

protein

서열의 길이가 길어 폴딩 과정이 복잡하고, protein 활성 유지 및 올바른 구조 확인이 필요함.

번역 후 변형(PTM)이 요구되는 protein의 경우, 비용이 더 증가함.

발현 수율이 낮거나 응집체가 형성되면 추가적인 처리 비용이 발생할 수 있음.

3차 구조와 가능성을 유지하면서 정제해야 하므로 고급 기술이 필요함.

peptide

protein보다 크기가 작아 발현 및 정제가 간단함.

대량 생산이 비교적 간단하기에 비용적 측면에서 유리함.

peptide만 발현되면 구조적 안정성이 떨어지고, 세포 내에서 빠르게 분해될 위험이 있음. (His-tag를 붙임으로써 극복 가능)

Alphafold를 사용해 후보군을 3D구조로 모델링한다.

RCSB PDB 데이터 베이스에서 BRCA1의 PDB 파일을 확보한다.

HADDOCK 사용해 BRAC1의 활성 부위에 후보군이 결합하도록 설정한다. (if. 활성 부위가 명확하지 않다면 전체 protein 표면을 대상으로 설정)

Docking 시뮬레이션을 실행해 Binding Energy(ΔG) 계산한다.

• ΔG가 낮을수록 표적 protein의 결합력이 강함

• 표적 protein과 peptide가 어떻게 상호작용하는지 시각화하여 수소 결합, 소수성 상호작용 등 분석 가능

ΔG가 가장 낮은 후보군을 최종 Xq peptide로 선정한다.

생물학적 발현

• 세균(E. coli), 효모, 곤충, 포유류 등에서 재조합 protein/peptide를 생산하는 방식

• 장점 : 발현 시스템을 최적화하면 고농도 peptide를 대량 생산할 수 있음.

• 단점 : 세포의 배양 조건, 발현 벡터 제작 등 초기 세팅 비용이 높음.

화학적 합성

• 아미노산 간의 peptide 결합을 통해 연결하여 peptide를 합성하는 방식

• 장점 : 화학적 조합만으로 즉시 설계 및 합성이 가능하며, 최적화 시간이 짧음.

• 단점 : 아미노산 서열이 길어지면, 합성 효율이 떨어지고 비용이 급격히 증가함.

박테리아 발현 시스템

• 장점 : 배양 시간이 짧고, 유전자 조작이 쉬우며, 고밀도로 성장하므로 대규모 발현에 적합.

• 단점 : peptide가 이황화결합과 당화와 같은 번역 후 변형(PTM)을 수행하지 못하기 때문에 불안정성이 증가하고 활성을 상실할 수 있음.

식물 발현 시스템

• 장점 : peptide가 PTM을 수행할 수 있으며, 식물 내에서 생산된 peptide는 인체에서와 매우 유사한 접힘 형태를 지님.

• 단점 : 상대적으로 peptide의 발현 정도가 낮고 식물 조직 배양 후 peptide를 얻기까지 시간이 오래 걸림.

X protein 서열을 AntiCP에 입력하고 prediction score가 0.7 이상인 것

3개를 Xq peptide 후보군으로 선정한다.

• 보통 항암 peptide의 수는 5~15 아미노산이므로 길이를 각각 설정해 10번의 AntiCP 진행

• Threshold = 0.7로 설정 시,

  0.7 이상 : peptide가 항암 활성 가능성을 가질 확률이 높음

  0.5~0.7: 모호한 영역 (더 많은 데이터나 추가 분석 필요

  0.5 미만: 항암 가능성이 낮음으로 평가

선정 기준

1. ISLLF 서열을 포함하고 있는 지

2. AntiCP 분석 결과 높은 prediction score를 가지고 있는 지

플라스미드 준비

1. Xq gene 준비:

   • PCR

   • 제한효소 처리

2. Vector 준비

3. Ligation

Transformation

Insert 확인

pilot scale - 대량 발현

Xq peptide의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템 개발

pDaval에 Xq peptide 유전자 서열을 삽입하고 E. coli를 형질전환하여

Xq peptide를 대량 발현할 수 있다.

CCK-8 assay 원리

암세포에 Xq peptide를 결합시키고 WST-8 시약을 처리함. WST-8이 세포 내 전자전달 효소에 의해 환원되어 황색 포르마잔을 생성함. 이때 생성된 황색 포르마잔의 OD450값을 측정하고 이 값이 낮을 수록 세포 생존율이 낮다고 할 수 있음.

실험 결과

= OD 450이 0.2~0.5 범위로 낮게 나타남

= 세포 생존율이 50% 이하로 감소했음을 의미

= 암세포에 Xq peptide가 적용되어 암세포의 성장을 억제함

=> Xq peptide는 항암 효과를 나타낸다.

Forward Primer 설계

5'-GGATCCctcctcatctctcttctcttc-3’

• GGATCC : BamHI 인식 서열

  ctcctcatctctcttctcttc : Xq gene 서열

• 길이 : 27

  GC 함량 : 51.9%

  Tm : 63.29

PCR (polymerase chain reaction):

• 준비물 : 5ul의 10x PCR buffer, 1ul의 deoxynucleotide mix, 제작 primer, 0.5ul의 Taq DNA polymerase, template DNA, 25mM MgCl2

• 실험 방법:

  1. PCR 반응액 조제: X gene, buffer(Taq pol, MgCl 포함), dNTP mix, primer를 tube에 넣는다.

  2. Denaturation: 94도에서 15 - 30초 처리해 이중가닥의 DNA를 단일 가닥으로 분리한다.

  3. Annealing: primer의 TM값인 62도의 3~5도 낮은 57~59도에서 30초 동안 반응한다.

  4. Extension: 72도에서 30초 동안 반응한다.

  5. 위 과정을 30~35번 반복

제한효소 처리:

• 준비물 : 10x reaction buffer 4ul, BamHI(20 U/ul) 1ul, HindIII(20 U/ul) 1ul, DNA 시료 20ul, DW 최대 40ul

• 실험 방법:

  1. total volume이 10ul가 되도록 mixture를 제작하기 위해 위의 volume의 PCR용 water을 넣어준다.

  2. 절단이 필요한 DNA를 5ul 넣어준다.

  3. 제한효소를 넣어준다.

  4. Reaction mixture를 섞어준 뒤, 마지막으로 tube 뚜껑을 닫고 tapping으로 섞어준 후 centrifuge로 spin down 시켜준다.

Xq peptide 회수 방법 (전기 용출)

준비물 : DNase/Rnase free water, 1x Ligation buffer, Ligase

실험 방법:

1. insert gene, vector, ligase와 ligation buffer를 준비한다.

2. Ligation buffer에 vector와 insert를 1:3의 비율로 삽입한다.

3. pipetting 후 centrifuge를 통해 spin down 시킨 후 잘 연결되게 16도에서 30분간 반응시킨다.

transformation 방법

heat shock 과정:

1. 얼음위에서 E. coli를 녹인 후, 약하게 섞어 14 ml round-bottom tube (Falcon tube 등)로 옮긴다.

2. E. coli (Competent cell) 100 μl를 1.5 ml-centrifuge tube에 옮긴 후 plasmid DNA 1λ을 가한다. 

3. 얼음에 30분간 방치한다.

4. 42℃에서 1분간 heat shock를 가한 후 얼음 위에서 2분 동안 방치한다.

배양 종류

준비물 : Native PAGE 젤(SDS 미사용), 전기영동 장치, native 샘플 버퍼, 전기영동 완충액(Tris-Glycine 등), 염색 용액 및 탈색 용액(Coomassie Blue 등), 전기용출(electro-elution) 장치

실험 방법

endotoxin

그람 음성균(E. coli)의 세포벽에 존재하는 독성 물질로, LPS로 구성되어 있음

--> E. coli를 사용해서 peptide를 대량발현, 정제할 경우 endotoxin이 아직 남아있을 수 있음.

endotoxin의 음전하 특성(pH 7.0)을 이용하여 이온 교환 레진에 결합시키는 방법

1. 컬럼 준비

   레진은 강염기성 음이온 교환 레진인 Q-레진을 쓴다.

   -> endotoxin에 레진이 결합하도록 만듦

2. 버퍼 준비-저염(low salt) 버퍼

   염이 너무 높으면 endotoxin과 레진의 상호작용이 감소하여 제거 효율이 떨어질 수 있기 때문에

   Tris-HCl 버퍼를 사용한다.

   -> 레진에 Xq peptide가 결합하지 않도록 하는 역할

Musite를 통해 확인

7Leu-13Phe(Xq peptide)에서 예측된 PTM 없음

준비물: Guanidium Lysis Buffer, lysate, Denaturing Binding Buffer,  Wash Buffer, Native Elution Buffer, 초음파 장치, 원심분리기

금속이온친화성크로마토그래피(IMAC)

• His-tag

• Ligand 종류

Ni-NTA

• 정제 조건 설정

• 정제 후 순도 분석 방법 선정

• 실험 시스템-ÄKTA pilot 600 시스템

펩타이드 양 :

• CCK-8 assay : 10~20 mg

• Caspase-3 ELISA : 10~20 mg

• In vivo 실험 : 100~200 mg

• 발현 및 정제 : 10 mg

순도 : 98%

• In vitro, vivo 모두 정밀 분석 과정이며 불순물이 섞여

  있으면 정확성과 재연성에 영향을 주고 독성을 유발할 수 있음

가격 : $100~$500 USD

준비물

ΔG 값

ISLLF : -8.0 kcal/mol

LISLLF : -7.5 kcal/mol

LLISLLF : -9.0 kcal/mol

= LLISLLF가 ΔG가 가장 낮고, 소수성 상호작용을 통해 BRCA1 protein과 강하게 결합

대량 배양

Lysate 추가 및 Denaturing Binding Buffer, Wash Buffer로 컬럼 세척한다.

AKTA Pilot 600의 디스펜서를 이용해 준비된 lysate를 컬럼에 추가한다.

Denaturing Binding Buffer 및 Wash Buffer로 컬럼을 세척하는 방법을 AKTA Pilot의 소프트웨어에서 설정한다.

펩타이드 용출

Native Elution Buffer를 사용하여 Xq peptide를 용출하고, 이 과정을 모니터링하기 위해 UV 검출기 사용한다.

세포 용해 및 초음파 처리

세포를 용해하는 동안 AKTA Pilot에서 펌프를 통해

Guanidinium Lysis Buffer를 주입한다.

초음파 장치를 별도로 사용해 얼음 위에서 세포 용해한다.

원심분리 후 AKTA Pilot 600의 샘플 체계에 시료 추가

고속 원심분리로 세포 찌꺼기를 제거한 후,

AKTA Pilot 600의 샘플 체계에 시료 추가한다.

샘플 적용

정제된 Xq peptide가 포함된 샘플을 컬럼에 적용한다. 이때 Xq peptide는 레진과 상호작용하지 않으면서,

endotoxin은 레진과 결합하게 된다.

세척 및 용출

저염 버퍼로 컬럼을 세척하여 endotoxin을 제거한다. Xq peptide가 포함된 용액은 컬럼에서 빠져나온다.

이후 LAL test 등을 통해 샘플에 남아있는 endotoxin 농도를 확인할 수 있다.

• 일반적으로 1EU/ml 이하의 endotoxin 농도가 의약품 또는 생물학적 제제에서 인체에 안전한 농도로 간주됨

샘플 준비: Xq peptide를 비변성 샘플 버퍼에 섞는다.

(예: Tris-HCl, 글리세롤, 브로모페놀 블루를 포함한 버퍼를 사용, SDS는 제외)

전기영동 수행: 전기영동 장치에 비변성 전기영동 완충액(예: Tris-Glycine)을

채운다. 샘플을 로딩한 후, 100~150V에서 전기영동을 진행한다.

Xq peptide가 이동하면서 본래의 구조를 유지한 채로 분리된다.

겔 염색: 전기영동이 완료되면 겔을 Coomassie Blue 염색액에 담가 염색한다.

탈색: 이후 탈색 용액으로 불필요한 염색을 제거한다.

식물 유래 항암 peptide/protein 발견 및 안정적인 생산, 정제 기술 개발

우수 항암 유전자의 확보

후보 항암 peptide/protein의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템 개발

후보 항암 peptide/protein의 pilot scale 유용정제법 확립

실험 결과

음성 대조군: 밴드가 없음

양성 대조군: 예상 위치(약 1.2kDa)에 밴드가 나타남

실험군: 양성 대조군과 같은 위치에 밴드가 나타남

=> 대량 발현된 Xq peptide를 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 통해

pilot-scale로 정제할 수 있다.

세포 수확 및 세척

실험 결과

음성 대조군: 밴드가 없음

양성 대조군: 예상 위치(약 1.2kDa)에 밴드가 나타남

실험군: 양성 대조군과 같은 위치에 밴드가 나타남

=> Xq peptide를 대량 발현할 수 있다.

Reverse Primer 설계

5'-AAGCTTgaagagaagagagatgaggag-3’

• AAGCTT : HindIII 인식 서열

  gaagagaagagagatgaggag : Xq gene의 역상보 서열

• 길이 : 27

  GC 함량 : 44.4%

  Tm : 61.98

PCR 최종 산물

GGATCCctcctcatctctcttctcttcAAGCTT

• 길이 : 33 bp

유가식 배양 시작

electrophoresis:

• 전기적 충격을 통해 세포막의 투과성을 변화시켜 외부 유전자를 도입시키는 방법으로 형질전환 효율은 높지만, 특수한 장비가 필요함.

  + )Competent cell: salt 농도가 낮은 상태로 준비

• 사용 strain: E. coli HST08 Premium Electro-Cells
  , E. coli DH5α Electro-Cells

DNA 손상 발생 시 암세포의 비정상적인 증식을 억제함으로 항암효과 발생

• DNA 손상 부위의 신호 분자와 motif가 결합하여 BRCA1을 손상 부위로 유도 -> 체크포인트 protein을 활성화하여 DNA 복구가 완료될 때까지 일시적으로 세포주기 정지 = 항암 효과 발생

LB 또는 S.O.C 배지 (cat no. EU100-SOC) 1.5 ml 를 가한 후 전체 용액을 test tube로 옮겨 37℃에서 30분 동안 shaking incubation한다.

PCR 결과 확인:

gel electrophoresis로 band 위치 확인한다.

PCR 최종 산물의 크기: 33bp

33bp에 밴드 존재 ⭕️ = Xq gene이 잘 증폭됨

-> 다음 단계로 넘어가기

33bp에 밴드 존재 ❌ = PCR 과정에서 오류가 발생함

-> PCR 재진행 또는 primer 재설계

IPTG 첨가하여 Xq peptide 과발현 유도

AKTA 배관에서 Guanidinium Lysis Buffer 직접 주입할 수 있도록 설정

AKTA Pilot의 배관에서 필요한 Guanidinium Lysis Buffer를 직접 주입할 수 있도록 설정한다.

세포 수확 및 재현탁

시료를 원심분리하여 세포를 수확하고, 준비된 버퍼에 재현탁한다.