1. Pegar uma lâmina de vidro limpa e seca.

2. Com uma caneta específica para lâmina, é feito um círculo no centro da parte inferior da lâmina (isso serve como referência para onde o esfregaço deve ser feito).

3. Utiliza-se uma alça de platina estéril para coletar a amostra (cultura bacteriana).

4. A amostra é espalhada em movimentos circulares dentro do círculo desenhado, formando o esfregaço bacteriano.

5. A lâmina foi deixada em repouso à temperatura ambiente até o esfregaço secar completamente.

6. Após a secagem, a lâmina é fixada passando rapidamente sobre a chama do bico de Bunsen por aproximadamente três vezes, com o esfregaço voltado para cima (essa etapa serve para fixar o material na lâmina, matando as bactérias e permitindo que elas adiram melhor ao vidro).

1. Aplicar o cristal violeta (violeta de genciana)
   Cobrir a lâmina com a solução de cristal violeta e deixar em contato com o esfregaço por 1 minuto. Esse corante é o corante primário e irá penetrar em todas as células bacterianas.

2. Aplicar a solução de Lugol (iodo)
   Remover o excesso do cristal violeta com água corrente. Em seguida, cobrir a lâmina com a solução de Lugol e aguardar 1 minuto. O Lugol age como mordente, formando um complexo com o cristal violeta no interior das células.

3. Descorar com álcool-acetona
   Aplicar rapidamente a solução de álcool-acetona por cerca de 15 segundos, promovendo a descoloração das bactérias Gram-negativas. Lavar imediatamente a lâmina com água corrente para interromper a ação do álcool.

4. Aplicar o contra-corante (Fucsina de Gram)
   Cobrir a lâmina com a fucsina e deixar agir por 30 segundos. Esse corante irá corar as bactérias Gram-negativas de rosa, já que perderam a coloração roxa na etapa anterior.

5. Lavar e secar
   Lavar a lâmina novamente em água corrente e secar delicadamente com papel absorvente (filtro), sem esfregar, apenas encostando o papel para retirar o excesso de água.

Na leitura, observa-se a coloração e a morfologia das bactérias:

• As bactérias Gram-positivas aparecem roxo-escuras, pois mantêm o corante cristal violeta mesmo após a descoloração.

• As bactérias Gram-negativas aparecem rosa-avermelhadas, pois perdem o cristal violeta na etapa da descoloração e se coram apenas com a fucsina.

Além da coloração, avalia-se também a morfologia (forma) e o arranjo das bactérias, como cocos, bacilos, diplococos, estreptococos, entre outros.