Al diseñar el ensayo, el fabricante o laboratorio, decide qué proteína específica, o proteínas, serán el objetivo. Si el ELISA se dirige directamente a una proteína situada sobre la bacteria o virus, se denomina ELISA de antígenos, mientras que, si el objetivo es la respuesta de anticuerpos del animal frente a la bacteria o virus, se conoce como ELISA de anticuerpos.

• La muestra en la cual se quiere detectar antígenos.

• Una concentración conocida de antígenos específicos para el anticuerpo fijado en el soporte, marcados con una enzima.

En otro pocillo de la placa, se añade una sustancia patrón y los conjugados. Se siguen luego los mismos pasos para ambos pocillos

Hay dos propiedades de las enzimas a tener en cuenta:

• El impedimento estérico: La enzima se une a un Ag o Ac, posteriormente ambas moléculas deben mantener su actividad, es decir, que el antígeno y el anticuerpo deben ser capaces de unirse formando un inmunocomplejo, y la enzima se debe unir al sustrato. Si alguna de estas moléculas es muy grande o se encuentran muy próximas, se produce un impedimento estérico que hace imposible alguna de las reacciones anteriores.

• La relación de conjugación: Cuantas más enzimas se puedan conjugar con cada anticuerpo, mayor será la intensidad de la señal.

Después del tiempo establecido, se realiza un lavado para eliminar los Ag que no se han fijado.

El más usado es la ortofenilendiamina (OPD).

• Si aparece color, la reacción es negativa: en la muestra problema no había antígeno y la totalidad de los antígenos fijados son antígenos marcados.

  
  

• Si no aparece color, la reacción es positiva: Los antígenos presentes en la muestra problema compiten y se desplazan a los antígenos marcados. La intensidad del color será inversamente proporcional a la cantidad de antígenos presentes en la muestra problema.

• Si las lecturas de ambas pruebas son análogas, el antígenos presente en la muestra problema no ha sido capturado por los anticuerpos empleados para tapizar el soporte.

  
  

• Si hay diferencia en las lecturas, el antígeno objeto de estudio es específico del anticuerpo empleado para tapizar el soporte, y la diferencia de densidad óptica entre el problema y el patrón es proporcional a la concentración del antígeno presente en la muestra problema.