기기 선정 기준

BCA protein assay reagents 100ml (Pierce, 23227 : 203,000원)

1ml의 BSA stock 용액 준비 (농도는 2mg/ml로 H2O에 녹임)

BSA 용액을 이용해 20-2000ug/ml 범위에서 8개의 희석 용액을 만들어 표준 곡선을 만듦.

BCA reagent A와 BCA reagent B를 50:1로 혼합해 working reagent(WR)를 만듦.

20 well에 12개의 단백질 sample을 넣고 8개의 표준 용액을 10ul 씩 넣음.

capture Ab를 coating buffer에 1ug/ml로 희석.

Ab 용액 50ul을 well에 첨가하고 clear plate를 덮은 후 실온에서 2시간 동안 흔들어서 well에 흡착.

well을 wash buffer로 3번 씻음.

각 well에 blocking buffer 200ul 첨가하고 실온에서 1-2시간 흔들어줌.

sample 100ul을 well에 넣고 실온에서 2시간 흔들어서 흡착.

well을 wash buffer로 3번 씻음.

=> plate가 capture Ab와 sample로 코팅되었으므로 detection Ab로 검출하는 단계를 진행.

ELISA coating buffer 1X (abcam, 120ml 73,500원)

capture Ab (고마바이오텍, mouse monoclonal Ab 주문 제작)

96 well microplate (abcam, 220,000원)

25X wash buffer (thermofisher, 100ml 113,000원)

blocker BSA (thermofisher, 200ml 252,000원)

protein sample

Unconjugated detection antibody (고마바이오텍, mouse monoclonal Ab 주문 제작)

Conjugated secondary antibody (sigma, Goat Anti-Mouse IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate, 373520원)

TMB solution (gendepot, 100ml 67,300원)

0.2N H2SO4 (덕산종합과학, 500ml 6,600원)

니켈, 코발트 등의 금속을 활용해 정제하는 방법. 일반적인 친화 크로마토그래피와 유사하며 6x His-tag를 가진 단백질을 선택적으로 선별할 수 있음.

일반적으로 아가로스 등에 니켈(II)이 고정되어 있는 column을 사용.

Imidazole과 같은 킬레이트를 활용하여 His-tag와 금속 이온의 결합을 끊어내어 단백질을 최종적으로 추출하는 Elution과정을 수행함.

단백질 샘플 준비

• His-tag 단백질이 포함된 용액을 binding buffer와 희석시킴.

• binding buffer는 일반적으로 pH 7-8 범위, 50mM Tris, 300mM NaCl을 사용.

• 샘플을 column에 흘려보내 His-tag 단백질이 결합하도록 함.

샘플 준비: 세포를 적절한 완충 용액(예: PBS, Tris-HCl)에 재현탁. 보통 세포 농도는 10-50%로 설정.

압력 설정: 초기: 10,000 psi (처음에 낮은 압력으로 시작). 최적화: 20,000~30,000 psi로 반복 처리.

반복 처리: 세포가 완전히 용해될 때까지 1~3회의 균질화 과정 수행.

온도 제어: 냉각 재킷 또는 얼음으로 샘플 과열 방지.

원심분리: 용해된 샘플을 원심분리하여 세포 파편 제거 후 상등액에서 단백질/핵산 회수.

Ammonium sulfate (덕산종합과학, 500g 5,830원)

1 M Tris-HCl, pH 7.5 (바이오니아, 500ml 29,000원)

1 X PBS , pH 7.2-7.4 (바이오니아, 500ml 26,000원)

Tube

단백질 용액을 150mL 준비.

질량 분석 스펙트럼을 얻음. 피크 사이의 질량 대 전하 비율을 차이를 이용해 아미노산 잔기 식별 가능.

단백질의 주요 피크 확인: 정제된 단백질이 반복된 피크로 나타나면 X단백질의 서열임을 알 수 있음. 다양한 불순물이 섞여 있으면 추가적인 불규칙적 피크들이 나타날 수 있음.

분자량 비교: 정제된 단백질의 분자량이 X단백질 분자량 값과 일치하는지 확인. 예상 분자량과 일치하지 않으면 실험 과정에서 정제가 제대로 되지 않았거나 단백질이 분해되었을 가능성이 있음.

두 단계의 질량 분석을 통해 샘플을 분석하는 방법

샘플을 ESI(Electrospray ionization)로 이온화 하고 첫 번째 질량 분석 진행.

CID(Collision-Induced Dissociation)를 통해 이온화된 단백질을 이온화된 peptide로 분해.

두 번째 질량 분석을 이온화된 peptide로 진행.

질량 대 전하 비율 스펙트럼 분석.

1차 질량 분석 (Q1)

가정 1

선행 연구에서 식물이 발현한 X 단백질에서 PTM에 의한 modification이 확인되지 않았다.

가정 2

E. coli 배양 과정에서 심각한 mutation이 발생하지 않는다.

BL21 계열: 단백질 발현을 위한 E.coli 균주로 높은 수준의 단백질 또는 peptide 발현을 위해 사용함. T7 RNA polymerase를 발현하기 때문에 T7 promoter를 사용하는 시스템 하에서 고수준 발현하고 단백질 발현에 필요한 protease가 결여되어 있어서 단백질 안정성이 높음.

DH5a: 유전자 클로닝 및 플라스미드 증식에 최적화된 균주로 배양이 쉽고 빠르지만 단백질 발현에는 적합하지 않음.

Heat shock: 열 충격을 통해 세포막을 일시적으로 투과성으로 만들어 외부 DNA가 세포 내로 들어갈 수 있도록 하는 방식. 주로 박테리아에 사용하고 비교적 간단해 큰 숙련도를 요구하지 않으며 세포 생존률이 높음.

Electroporation: 전기 충격을 이용해 세포막의 투과성을 일시적으로 증가시키는 방식. 구매 비용 높고 고전압이 가해질 때 세포가 과도한 스트레스를 받아 세포 손상이 발생할 수 있음.

competent cells (BL21 Star (DE3)) 50ul (thermofisher 100ul 16,000원)

LB media 500ul

LB plates with proper antibiotics (AMP 포함) (생물나라 5,500원)

제작 Plasmid (vectorbuilder 200,000원)

-80°C에서 competent cell을 꺼내 얼음 위에 20분 동안 보관.

1.5ml tube에 녹인 competent cell 50ul에 plasmid 10ng를 추가하고 pipetting. (변형 효율을 저하시키므로 vortexing하지 말 것)

반응 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양.

반응 혼합물을 water bath 42°C에서 30초 동안 놓아 세포에 열 충격을 가함.

열 충격 후 세포를 얼음 위에 2분간 incubation.

ampicillin (kisanbio 5g, 29,000원)

재료들을 1L pyrex 병에 넣음.

마그네틱 바와 교반기를 이용해 배지를 녹여줌.

autoclave를 이용해 121'C에서 15분 동안 멸균함.

배지를 약 50'C 이하로 식혀준 후 ampicillin 50mg을 넣어줌.

pipet을 사용해 20ml 씩 분주해서 20개의 배지를 만듦.

소독된 도말 루프로 배양된 colony의 일부를 긁어서 루프에 붙임.

루프를 배지에 넣고 흔듦.

37'C에서 3시간 동안 배양

각각의 배지에 IPTG 4.766mg을 넣음 (최종 농도 0.5 mM)

37'C에서 24시간 동안 배양.

10ml의 E. coli 배양액을 50ml tube에 옮김.

8000 rpm에서 3분간 centrifuge.

pellet이 만들어지면 -80'C에서 1시간 보관.

pellet을 NPI-10 buffer (1L, 140,000원) 40ml에 재현탁.

세포 현탁액을 ice bath에 보관해 tube가 단단히 고정되게 함.

Sonic probe를 세포 현탁액에 잠기게 함.

Sonic probe를 60kHz로 설정하고 30초간 작동 후, 1분간 냉각.

이 과정을 5번 반복해 lysis함.

lysis 후, 세포 잔해를 12000rpm, 4'C에서 20분 centrifuge.

상층액을 새로운 tube로 옮김.

(상층액에는 단백질과 기타 용해 물질이 남음.)

OD 값 확인

ELISA 결과에서 각 well의 OD 값이 높을수록 X 단백질의 발현량이 많음.

20개 배지 중에서 가장 높은 OD 값을 보인 배지를 선택.

가설 1

X 단백질을 대량 발현하는 E. coli를 제작 가능하다.

가설 2

X 단백질이 발현된 E. coli에서 pilot-scale로 X 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다.

새로운 생산 기술을 채택하고 실험실 규모의 정제 및 생산 방법을 실제 대량생산에서 가능한지 확인하는 단계.

생산 비용을 분석하고 경제적으로 적합한지 확인하는 단계. 다만 동시에 연구의 목적도 가지고 있기에 어느 정도의 경제성의 희생이 있을 수 있음.

이 과정에서 품질과 수율이 일정하게 유지되는 것을 목표로 함.

Capture

Intermediate Purification 

Polishing

강력한 발현 수준
T7 promoter는 매우 강력한 promter로 T7 RNA polymerase와 결합할 때 높은 수준의 단백질 발현을 유도. 이는 대량 발현이 필요한 실험에서 유리.

특이성
T7 RNA polymerase는 T7 promoter에만 특이적으로 결합하므로 목표 단백질만 선택적으로 발현시킬 수 있음.

Bacto-tryptone 5g (Thermofisher 500g, 180,000원)

Yeast extract 2.5g (생물나라 100g, 33,000원)

NaCl 5g (덕산종합과학 500g, 4,950원)

dH2O 500mL (바이오니아 500ml, 15,000원)

1. 재료들을 1L pyrex 병에 넣음.

2. 마그네틱 바와 교반기를 이용해 배지를 녹여줌.

3. autoclave를 이용해 121'C에서 15분 동안 멸균함.

peptide: 아미노산이 2개에서 50개 정도 결합된 짧은 폴리펩타이드 사슬이고 peptide만으로도 기능 수행 가능. (ex: insulin, Bac7)

protein: 보통 50개 이상의 아미노산으로 구성되어 수차례의 3차원 구조를 형성하여 기능 수행. (ex: hemoglobin, p53)

Xq peptide: X protein에 있는 기능과 관련된 부분으로 항암 효과를 발생시키는 X protein의 아미노산 구성 중 일부분.

Metal Affinity Chromatography

BCA assay

Tandem Mass spectrometry

Pilot scale purification

LB 배지 만들기

Heat Shock

Cell Culture

Cell lysis

Salting out

Sandwich ELISA

Ni-NTA

pilot scale에 적합한 30L 발효조에서 E. coli를 배양한다.

온도 : 37°C

공기 공급 속도 : 1 vvm

pH : 7.0

배양시간 : 36시간

목표 단백질에 Affinity가 있는 ligand를 사용해 목표 물질을 capture함.

Capture 단계의 가장 중요한 목적은 purity가 아닌 높은 회수율. 

단백질이 단백질 분해 효소에 분해되지 않도록 빠른 시간에 농축해서 최대한 많은 단백질을 회수하는 것이 중요. 

이 단계에서는 capture에서 잡힌 단백질인 목적 단백질과 대량의 불순물을 분리하면서 purity를 높이는 것에 목적을 가짐. 

이 단계에서는 전 단계에서 모은 높은 purity의 목적 단백질을 한 번 더 최상의 purity로 갖기 위한 단계. 

이는 단백질이 monomer, dimer, oligomer와 같이 여러 상태이거나 응집된 상태로 존재하기 때문. 

단백질 의약품 제작일 경우 endotoxin을 제거해야 하고 구조 생물학 용도에서는 oligomer 상태를 제거한 후 monodispersed 상태만 선택해야함.

사용 또는 보관에 필요한 pH, 염 또는 첨가제를 최종적으로 조정해도 됨.

Positive control: SS바이오의 순수 X 단백질 샘플

=> ELISA가 X 단백질에 대해 특이적으로 작동하는지, 항체가 제대로 결합하는지 확인하기 위해 사용. (강한 신호가 발생)

Negative control: X gene으로 형질전환되지 않은 BL21 Star(DE3) 샘플

=> 비특이적 결합이나 백그라운드 신호를 확인하기 위해 사용

실험군: X gene으로 형질전환된 BL21 Star(DE3) colony 20개

사용되는 resin : 500ml, 5,166,000원

가정 1

단백질 정제율은 약 10g/L 이다.

빠른 전사 속도
T7 RNA polymerase는 T5 promoter에 의존하는 전사보다 더 빠르게 RNA를 합성할 수 있어 단백질 생산 속도가 더 빠름.

비표적 단백질 발현 감소
T7 promoter는 일반적으로 세포 내에서 비활성 상태로 유지되다가 T7 RNA polymerase가 제공될 때만 활성화. 이는 비표적 단백질의 발현을 줄이는 데 도움이 됨.

Ab를 blocking buffer로 희석.

detection Ab 100ul을 각 well에 넣고 플레이트를 덮고 실온에서 2시간 배양 후 well을 wash buffer로 3번 씻음.

2차 Ab 100ul을 각 well에 첨가 후 실온에서 1-2시간 배양 후 well 을 wash buffer로 씻음.

각 well에 효소 기질 용액(TMB) 50ul을 넣고 plate를 교반하면서 배양.

각 well에 정지 용액(0.2N H2SO4) 100ul 첨가 후 1분간 섞어줌.

plate reader로 450nm에서 결과 확인.

Ni-IDA

25,000 xg에서 4 ºC에서 20분 동안 centrifuge하여 침전된 단백질을 pellet화함.

상등액을 제거함 (pellet이 남음).

pellet을 PBS, pH 7.2에 재현탁함. (용액은 탁한 상태로 유지되지만 눈에 띄는 응집체는 보이지 않음).

잔류 침전물 제거를 위해 25mL 튜브로 4 º에서 25,000 xg에서 10 분 동안 centrifuge함.

8,9번을 한 번 더 반복해 ammonium sulfate를 washing함.

LB 500uL를 추가.

튜브를 37°C의 shaker(180rpm)에 1시간 동안 둠.

incubation 후 4000rpm에서 2분 동안 centrifuge 후 상층액 400ul를 따라냅니다. pellet을 남은 상등액과 혼합.

혼합물을 10uL과 90uL로 나누어 적절한 LB agar plate에 퍼뜨림.

plate를 밤새 37°C에서 배양.

배양 12~16시간 후, plate에서 colony가 생성.

2차 질량 분석 (Q3)

각 well에 200ul의 WR을 추가.

37'C에서 30분 동안 반응시킴.

실온에서 10분 동안 반응 후 측정 준비.

plate reader로 562nm에서 흡광도 측정.

표준 곡선 방정식에 대입해 단백질의 농도 도출.

농도 확인 후 Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)를 위해 시료 농도를 10ug/ul로 조정

세척

• column에 남아있는 비특이적 결합을 제거하는 단계.

• 세척 버퍼에 낮은 농도의 imidazole(20-50mM)을 포함해 비특이적 결합 단백질만 제거.

• 이때 강한 환원제(DTT 등) 사용 시 니켈이 용출될 수 있으므로 주의.