1.1. Tricomoníase - parasitologia/fisiopatologia da doença

1.1.2 Epidemiologia

1.1.2.1 Problemática - subnotificação

1.1.3 Tratamentos - posologia/ mecanismo de ação

1.1.3.1 Resistência

2. Uso de compostos naturais no tratamento de doenças parasitárias

3. Busca de novos alvos terapêuticos/ formas de tratamento

3.1. Plantas com atividades anti Trichomonas vaginalis / fases de estudo (O que já temos publicado nos últimos 5 anos (2019 - 2024)?

3.1.2 Mecanismos de ação (são diferentes de nitroimidazóis? O que se sabe?)

4. Novas perspectivas para o futuro

Alguns pontos específicos que eu gostaria de trabalhar pra atingir esse objetivo são:

1- Finalizar as figuras de uma forma que fiquem mais didáticas para o leitor

2- Trabalhar em uma forma que fique menos engessada para apresentar os resultados escritos

3- Conectar a discussão entre os pontos do trabalho de forma que as sessões conversem melhor entre si

4- Terminar a escrita de duas sessões dos resultados e discussão que faltam.

5- Dicas de como enlaçar o trabalho com uma boa conclusão.

Listei os tópicos principais e as figuras que estao em andamento (Fig 1 e Fig 2 - genomic features e filogenia)

1. Trichomonas vaginalis - aspectos do patógeno

1.1. Tricomoníase - transmissão/fisiopatologia da doença

1.1.2 Epidemiologia

1.1.2.1 Problemática - subnotificação

1.1.3 Tratamentos - posologia/ mecanismo de ação/ falhas

1.1.3.1 Resistência

2. (Busca por novas alternativas) Uso de compostos naturais no tratamento de doenças parasitárias

3. Busca de novos alvos terapêuticos/ formas de tratamento

3.1. Produtos naturais com atividades anti Trichomonas vaginalis / fases de estudo/ limitações (O que já temos publicado nos últimos 5 anos (2019 - 2024)?

3.1.1 Produtos provenientes de plantas/ produtos provenientes de fungos / produtos provenientes de organismos marinhos

3.2. Mecanismos de ação (são diferentes de nitroimidazóis? O que se sabe?)

3.2.1 Tipos de morte do parasito encontradas

4. Novas perspectivas para o futuro

1. Obtenção dos compostos com potencial bioativos

O nosso grupo de pesquisas faz parte do INCT – Probiam Pharmaceuticals Amazônia (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia - Prospecção de biocompostos amazônicos com potencial ação contra agentes infecciosos emergentes e/ou resistentes para obtenção de produtos farmacêuticos), em parceria com outras universidades. Os compostos serão enviados pela Universidade Federal do Pará (UFPA), onde estão sediados o Laboratório de Biotecnologia e Bioprocessos e o Laboratório de Engenharia de Processos de Conversão de Biomassa e Resíduos: Sustentabilidade, Biorrefinaria, Bioenergia e Bioprodutos, que estão trabalhando para produzir, caracterizar e padronizar insumos com a finalidade de desenvolvimento de pesquisas focadas em formulações farmacêuticas a partir de biocompostos provenientes da Amazônia.

2. Cultivo in vitro de T. vaginalis

Será utilizado o isolado padrão da American Type Culture Collection (ATCC) 30236, e também isolados clínicos frescos de T. vaginalis, que são provenientes do Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia da UFRGS (autorização CEP/UFRGS número: 18923). Os isolados clínicos estão criopreservados a -80 e -196°C no banco de isolados de T. vaginalis do nosso grupo, e serão descongelados somente no momento do experimento, se mantendo viáveis para uso no máximo por 15 dias. Os trofozoítos serão cultivados no meio trypticase-extrato de levedo-maltose (TYM) (DIAMOND, 1957), pH 6,0, suplementado com 10% de soro bovino adulto (SBA) estéril inativado e penicilina/estreptomicina, e mantidos em condições microaerófilas a 37°C. As culturas em fase de crescimento logarítmica que apresentarem trofozoítos viáveis (motilidade e morfologia normais) serão utilizadas para realização dos experimentos.

3. Screening de atividade anti- T. vaginalis dos insumos provenientes da Amazônia

A atividade anti- T. vaginalis dos insumos será testada frente a ATCC 30236, em triplicata. Será utilizado o DMSO como veículo para solubilizar os compostos na concentração final de 0,6%. Serão ajustadas as triplicatas de cultura de T. vaginalis, previamente realizadas no dia anterior ao experimento, para a densidade de 2,0 x 105 trofozoítos/mL, no dia do experimento. O ensaio será realizado em placas de micro titulação de 96 poços com 50 uL de cada composto solubilizado com DMSO, e 150 uL de cultura padronizada contendo T. vaginalis. Após 24h de incubação a 37ºC em incubadora de 5% de CO2, a viabilidade dos trofozoítos será analisada por contagem em hemocitômetro, utilizando o corante de exclusão Azul de Tripano (0,4%). Serão feitos 2 controles: controle positivo de T. vaginalis, utilizando meio de cultura TYM no lugar da solução com composto, e controle de veículo, utilizando uma solução com DMSO a 0,6% e meio de cultura TYM.

Para os próximos experimentos, serão utilizados os compostos que reduziram a viabilidade dos trofozoítos em 100% no screening inicial, descrito neste item.

4. Determinação de MIC e IC50

Os experimentos serão realizados in vitro, através de diluição seriada. Os trofozoítos serão incubados com os compostos em placas de micro titulação de 96 poços, pelo tempo de 24h a 37ºC, em incubadora com 5% de CO2. Será realizada a quantificação da viabilidade dos trofozoítos por meio de através contagens em hemocitômetro, utilizando o corante de exclusão Azul de Tripano (0,4%). A viabilidade será avaliada como a porcentagem de trofozoítos viáveis em comparação ao controle negativo (que contém 100% de trofozoítos viáveis). O valor de MIC será obtido após incubação em meio TYM livre de compostos e avaliação do crescimento dos trofozoítos até 120h. O valor de IC50 será definido através do software GraphPad Prism6, através do modelo de regressão não linear.

5. Análise da cinética de crescimento de T. vaginalis

Para a análise da cinética de crescimento do parasito, frente aos compostos bioativos, será utilizado o isolado ATCC 30236 cultivado em meio TYM contendo o composto ativo na concentração correspondente de CIM, determinada previamente. O número de trofozoítos será contado em hemocitômetro com o corante Azul de Tripano (0,4%) nos tempos 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas, considerando motilidade e morfologia normais, e será expresso como número de trofozoítos/mL.

6. Análise de toxicidade dos compostos bioativos em eritrócitos humanos

Para a determinação da toxicidade dos compostos em eritrócitos, será utilizado o protocolo descrito em Hübner et al., 2016. Os eritrócitos serão obtidos a partir de sangue heparinizado provenientes de doadores humanos saudáveis (CEP n°___). Uma suspensão a 1,0% de eritrócitos será preparada e será incubada com os compostos no valor de IC50 durante o tempo de 1h e 24h. Será coletado o sobrenadante e medida a absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 540 nm. Os resultados serão expressos em porcentagem de hemólise de cada amostra testada e serão comparados a 100% de hemólise causada pelo controle positivo (Triton X-100 1%).

6.1 Obtenção das amostras de sangue

Amostras de sangue humano fresco serão coletadas de participantes saudáveis, com idade entre 18 e 60 anos, utilizando heparina como anticoagulante. A participação será voluntária, sujeita à concordância e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), que deverá ser assinado antes da coleta. As coletas de sangue ocorrerão no Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia da UFRGS. Serão realizadas, no máximo, duas coletas de 10 mL por participante.

7. Análise de citotoxicidade dos compostos bioativos em células do epitélio vaginal e determinação do índice de seletividade

O protocolo de análise de citotoxicidade será realizado conforme descrito em Oliveira et al., 2023. Um dia antes do experimento, as células epiteliais vaginais humanas de melanona (HMVII) (CEP nº___) serão semeadas em placa de microtitulação de 96 poços e mantidas a 37ºC em incubadora de CO2 durante a noite, até a formação da monocamada. Após esse período, o meio RPMI-1640 com suplementação de 20% de soro bovino fetal será substituído pelos insumos em concentrações diferentes mais meio suplementado. O controle positivo será Triton X100 0,02% e o veículo será o DMSO 0,6%. As placas serão colocadas em incubadora de CO2 a 37 °C por 48h. A viabilidade celular será avaliada pelo ensaio MTT, conforme descrito em Sieuwerts et al., 1995. O valor que reduz a viabilidade celular em 50% comparada ao controle, CC50, (Concentração Citotóxica) será determinado através do software GraphPad Prism6 pelo modelo de regressão não linear e o Índice de Seletividade (IS) será obtido pela razão CC50/IC50.

8. Ensaio de associação dos compostos bioativos que desempenharam atividade anti- T. vaginalis com metronidazol

Para verificar qual o tipo de associação que os compostos possuem com o metronidazol, se é sinergismo, indiferença, antagonismo ou aditismo, será utilizado o método de Checkerboard para combinação de fármacos, descrito em Lewis et al., 2002. Será utilizado o isolado de T. vaginalis TV-LACM15, que possui CIM = 73 uM, o que é considerado uma resistência moderada ao metronidazol.

9.0 Análise de produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) pelos parasitos

Os parasitos serão tratados ou não com os insumos durante o tempo de 30 minutos. Após incubação, o acúmulo de EROs será determinado por citometria de fluxo, utilizando o corante 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) (Sigma) (Seo et al., 2014).

10. Análise do tipo de morte celular causada em T. vaginalis:

    10.1 Citometria de fluxo

Para avaliar o tipo de morte, a ocorrência de apoptose será investigada pela detecção da exposição da fosfatidilserina pela marcação com anexina V conjugada ao corante FITC. A citometria será realizada usando o citômetro de fluxo BD FACSVerse, com 20000 aquisições, e os dados serão analisados com o programa BD CellQuesT.

10.2 Microscopia Eletrônica

Será realizada conforme descrito em Giordani et al., 2010. As amostras serão observadas com microscópio eletrônico de varredura Jeol 6060 ou de transmisssão Jeol 1210 no Centro de Microscopia e Microanálise (CMM) da UFRGS.

• objectives and refencial theoretical done

  
  

To do:

Adjust font size from all figures to be more harmonic and uniform

Write Section 3.4 and conclusion.

Make Figure 5 from Section 3.4.

The plan is to finish everything until next thursday!

Conclusion was added to the manuscript.

Some figures still need some small tweaks.

Started writing the review