Sense colorants

Permet observar organismes vius (observació in vivo)

S’utilitza per a l’estudi de cultius en medis líquids per observar si existeix moviment dels bacteris i/o la reactivitat amb substàncies químiques o sèrums

Per evitar que s'evapori el medi, a vegades s’utilitza la tècnica de la gota pendent.

Permet incrementar el contrast entre el bacteri i l'entorn

Ús de colorants que acoloreixen determinades substàncies o estructures bacterianes

Per aconseguir una major sensibilitat, sobretot en la detecció de certes espècies bacterianes en extensions directes de mostres biològiques molt contaminades

Requereixen un microscopi de fluorescència per visualitzar el resultat

Poden ser Directes o Indirectes

Col·locar una gota del medi de cultiu al portaobjectes

Cobrir amb un cobreobjectes

Observar al microscopi

Col·locar una gota de medi de cultiu líquid sobre el centre d’un cobreobjectes i algunes gotes d’oli d’immersió o vaselina a les vores o els vèrtex

Col·locar el cobreobjectes invertit (la gota a la cara inferior) sobre un portaobjectes excavat

Observar al microscopi òptic amb el condensador baix per augmentar el contrast o amb un microscopi de contrast de fases

Àcids/aniònics --> càrrega negativa, s'uneixen a substàncies o estructures amb càrrega positiva, com proteïnes i citoplasma. Ex: vermell Congo, rosa de bengala, eosina, fucsina àcida

Bàsics/catiònics --> càrrega positiva, s'uneixen a substàncies o estructures amb càrrega negativa, com àcids nucleics i paret bacteriana. Ex: cristall violeta, blau de metilè, fucsina bàsica, verd de malaquita, safranina

Neutres/amfòters --> Tenyeixen tot tipus d'estructures, predominant un color o un altre en funció del pH de la tinció. Ex: eosinat de blau de metilè

S'utilitza un sol colorant

Tots els bacteris de l'extensió es tenyeixen per igual

No permeten diferenciar bacteris

S'utilitzen per l'estudi de morfologia individual, mida i agrupaments

S'utilitzen dos colorants

Els bacteris es tenyeixen diferent

Permet distingir bacteris amb la mateixa morfologia per les seves propietats tintorials diferents

Per tenyir estructures concretes, presents només en algunes espècies bacterianes

Especial importància en taxonomia

Realitzar extensió

Cobrir extensió amb blau de metilè durant 2 minuts a temperatura ambient

Rentar amb aigua destil·lada

Assecar a temperatura ambient

Observar al microscopi

Col·locar una gota de nigrosina en un extrem del portaobjectes.

Carregar una nansa de sembra amb la mostra que es vol tenyir.

Emulsionar la mostra amb la nigrosina utilitzant la nansa de sembra.

Fer una extensió o frotis, a mode de pel·lícula fina, col·locant un segon portaobjectes net sobre la gota de nigrosina amb la mostra i lliscant al llarg del primer portaobjectes en un angle de 45°.

Deixar assecar a temperatura ambient

Observar al microscopi

Tinció més utilitzada en micro

Permet distingir dos grups principals de bacteris:

• Gram+: blaus o violaci fosc

• Gram-: rosa intens o vermell

Fer extensió i fixació de la mostra

Tenyir amb cristall violeta durant 1 minut

Rentar suaument amb aigua destil·lada a poca alçada

Afegir lugol (mordent) durant 1 minut

Rentar suaument amb aigua destil·lada a poca alçada

Decolorar amb alcohol fins que deixi de sortir colorant

Rentar suaument amb aigua destil·lada a poca alçada

Tenyir amb safranina durant 1 minut

Rentar suaument amb aigua destil·lada a poca alçada

Assecar a temperatura ambient

Observar al microscopi

Tinció diferencial que permet distingir bacteris BAAR (àcid-alcohol resistents)

Bacteris amb paret diferent (peptidoglicà unit a lípids, glicolípids i ceres) d'aspecte cerós, caràcter hidrofòbic i una elevada resistència a la dessecació i a agents químics antibacterians. Ex: Mycobacterium tuberculosi

Fer extensió

Posar fucsina

Escalfar sense deixar que s'aixugui

Rentar amb aigua destil·lada

Posar àcid-alcohol en fred

Posar blau de metilè

Rentar amb aigua destil·lada

Eixugar

Observar al microscopi

Difícils de tenyir degut a la seva composició química

Se solen utilitzar tincions negatives: nigrosina/tinta xina i Hiss

Tinció complexa per la seva localització a l’interior del cos cel·lular i la seva estructura amb vàries capes impermeables

La tècnica més empleada és la tinció de Wirtz-Conklin (sobre extensions fixades per calor)

Els flagels son estructures filamentoses tan fines que no són visibles de forma natural al microscopi òptic. Per visualitzar-los calen compostos químics que es dipositin sobre ells, recobrint-los i augmentant el seu gruix.

Es realitza barrejant una suspensió bacteriana amb tinta xina i visualitzant la mescla entre portaobjectes i cobreobjectes. La càpsula impedeix el pas de la tinta xinesa. Així, els bacteris amb càpsula es veuen com petites bombolles brillants sobre un fons negre

Existeix un procediment alternatiu de la tinció amb tinta xina a partir d’una extensió assecada a temperatura ambient

Tenyir l’extensió amb una solució aquosa de cristall violeta a l’1%

NO RENTAR

Tractar l’extensió amb una solució aquosa de sulfat de coure al 2%.Els sulfat de coure decolora la càpsula, però no el cos cel·lular bacterià.

Rentar

Tinció de l’extensió amb una solució de fucsina diluïda

Rentar l'excés de colorant

Col·locar una gota de tinta xinesa sobre l’extensió

Cobrir amb un cobreobjectes

Observar al microscopi

Utilitza àcid tànic per a recobrir el flagel i rosanilina per a tenyir el conjunt. Els flagels s’observen en tons rosacis o blavosos

Utilitza nitrat d’argent amoniacal i un mordent. Els flagels es veuen negres

Passar 3-4 vegades el portaobjectes per la flama

Preparar una suspensió bacteriana

Preparar un tub d’assaig amb aigua destil·lada

Seleccionar vàries colònies de la placa amb la nansa de Kolle

Barrejar les colònies amb l’aigua fins que es disolguin

Fer una extensió

1. Amb la nansa de Kolle agafar 5 gotes de mostra i es distribueixen de la següent manera: 4 gotes a les cantonades i una al mig.

2. Fixar la mostra sense flama

3. Deixar eixugar a l’aire durant 5 minuts

Cubrir la mostra amb el el mordent i deixar-la en repòs a temperatura ambient durant 10 minuts.

Rentar amb aigua destil·lada molt suaument per no endur-nos la mostra fixada

Afegir el colorant safranina durant 10 minuts

Rentar l’excés de colorant suaument

Deixar eixugar la mostra a l’aire

Observar els resultats al microscopi

Cobrir l’extensió amb una solució de verd de malaquita al 5% i escalfar el portaobjectes per sota amb un encenedor durant 5 min. S’ha d’evitar que el colorant entri en ebullició i s’assequi

Rentar l’excés de colorant amb abundant aigua.

Cobrir l’extensió amb una solució de safranina al 0,5%. Aquest és el colorant de contrast per tenyir les formes vegetatives.

Rentar l’excés de colorant amb abundant aigua i deixar assecar la preparació.

Es basen en l’ús de colorants fluorescents: compostos químics que tenen la capacitat d’emetre llum visible d’una determinada longitud d’ona quan s’exciten amb llum ultraviolada

Es basen en l’ús d’anticossos marcats amb fluorocroms o fluoròfors i permeten detectar antígens concrets en els bacteris. Aquest tipus de tincions solen comercialitzar-se en forma de kits; són molt ràpides i aporten bons resultats

Colorant fluorescent que s’uneix inespecíficament a tots els àcids nucleics (DNA i RNA) de bacteris i cèl·lules

Per detectar micoplasmes i en algunes mostres biològiques en les que es sospita una baixa càrrega bacteriana o la presència de bacteris que es tenyeixen malament amb les tincions convencionals

Fonament similar a la de Ziehl-Neelsen amb la diferència de que no cal escalfar la preparació

Permet distingir els BAAR de la resta de bacteris, que no retenen el colorant

La visualització microscòpica ha de fer-se el més aviat possible; en cas contrari, les preparacions es poden guardar a la nevera i en foscor fins 24h

La preparació es pot visualitzar primer amb llum transmesa visible i a continuació amb fluorescència

Després de fer aquesta tinció, la preparació es pot retenyir amb la tinció de Ziehl-Neelsen, però mai a l’inrevés

Els temps d’incubació poden variar segons la marca comercial de l’equip que s’utilitzi, de manera que cal revisar les indicacions del fabricant de cada kit de tinció

Cobrir l’extensió amb una solució de taronja d’acridina i incubar 2 min a temperatura ambient (sense que s’assequi).

Rentar amb aigua destil·lada i deixar assecar a temperatura ambient.

Visualitzar amb microscopi de fluorescència. Els bacteris i els nuclis cel·lulars es veuen en groc fluorescent sobre el fons fosc

Inundar la preparació amb una solució d’auramina-rodamina filtrada i incubar durant 12–15 min a temperatura ambient (no escalfar).

Rentar amb aigua destil·lada.

Decolorar amb alcohol-àcid durant 3 min. Aquest tractament elimina el colorant dels bacteris no BAAR.

Rentar amb aigua destil·lada.

Cobrir amb solució de contrast (permanganat potàssic al 0,5% en aigua destil·lada) i incubar durant 2–3 min a temperatura ambient. Una alternativa és el vermell tiazina.

Rentar amb aigua destil·lada.

Deixar assecar a l’aire