• Saco plástico comum 

   transparente; 

 • Detergente comercial; 

 • Água; 

 • Béquer ou copo; 

 • Colher de medida (colher de 

     café); 

 • Proveta; 

 • Álcool etílico absoluto (Deve ser 

mantido gelado até o momento da 

sua utilização); 

 • Gaze para filtrar; 

 • Tubo de ensaio; 

 • Cloreto de sódio; 

 • Funil; 

 • Faca; 

 • Bastão de vidro;

 •Pipeta Pasteur.

 

 Em um béquer misturar 6mL de detergente, 4g de NaCl 

(4 colheres de sal) e água qsp

 para 60mL de solução.

 

2 ) E X T R A Ç Ã O   D E   D N A
 -Cortar  e macerar  a banana com  a  solução  de lise, no saco plástico, até se obter uma solução liquefeita.

-Misturar  a  solução  durante  2  a  3  minutos  e,  em seguida, filtrar utilizando gase, funil e o tubo de ensaio

- Depois  de  filtrar,  acrescentar  lentamente  o  álcool etílico 

absoluto gelado com auxílio da pipeta 

de pasteur.

 

 

-Pesar  0,05g  (50mg)  de  farelo  de  soja  de  cada  uma  das  amostras 

desejadas e colocar em um tubo ependorff de 2,0 mL identificado.

 -Adicionar em cada tubo 700μL de Solução de Lise e homogeneizar bem utilizando o vórtex.

 - Adicionar  10μL  de  Proteinase  K  (20mg/mL)  e  homogeneizar  a  mão  ou 

rapidamente em vórtex.

 -Deixar em banho seco a 55ºC overnight.

 

 

-Adicionar  700μL  de  Clorofórmio,  homogeneizar  em  vórtex  e  resfriar  no 

freezer por aproximadamente 10 minutos.

 -Centrifugar  as  amostras  à  10.000  rpm  por  10  minutos  (enquanto  isso, identificar novos tubos de 1,5mL para transferir o sobrenadante).

 -Retirar o sobrenadante e transferir para um novo tubo de 1,5mL, adicionar 

700μL de Clorofórmio, homogeneizar suavemente e centrifugar a 10.000 rpm por 

10 minutos.

 -Retirar o sobrenadante e transferir para 

novos tubos de 1,5mL identificados  com  o  nome  da  amostra,  data,  finalidade  e  nome  de  quem  fez  a extração. Em seguida adicionar igual ou maior volume de Isopropanol gelado e homogeneizar suavemente até o DNA precipitar (formar “nuvem”) Centrifugar  a  10.000  rpm  por  3  minutos,  retirar  o  Isopropanol  por  inversão retirando o excesso que sobrar com o auxílio de papel toalha.

 -Adicionar 300μL de Álcool 70%, homoge

neizar suavemente e centrifugar a 10.000 rpm por 5 minutos.

 -Descartar o Álcool 70% por inversão, retirar o excesso com o auxílio de 

papel toalha. É importante que não fique nenhum resquício de Álcool, por isso, 

se  for  possível  colocar  os  tubos  abertos  no  banho  seco  a  37ºC  até  que  todo álcool evapore.

 -Por último, adicionar 200μL de Tampão TE e deixar por 48 horas na geladeira 

para o DNA reidratar. Caso a amostra for ser usada no dia seguinte, adicionar o 

Tampão TE na mesma e deixar no banho seco a 37ºC overnight.

 -Se  não  estiverem  sendo  usadas  as  amostras  devem  ser  guardadas  na 

geladeira, e se não forem mais ser usadas devem ser descartadas.

 

 

•Assepsia do local de trabalho;

 

•Amostras de DNA que serão amplificadas devem ficar em banho

-maria 56°C 30’ ou 37°C 60’.

 

•Fazer os cálculos de cada volume dos reagentes necessários antes de entrar na sala.

 

 

 -Mix deve ficar em banho de gelo.

-Taq polimerase é a última a ser pipetada e a última a ser retirada da geladeira, pois é 

degrada pelo calor.

-Após pipetagem do volume total do mix, dividir nos eppendor

fs 0,2mL e pipetar 3uL de DNA.

-Identificar os tubos.

 

– PREPARO DO GEL DE AGAROSE

 Pesar  3g  de  agarose, adicionar  150mL de  TBE  1X  e  levar  ao  microondas, 

colocando  pequenos  intervalos  de  tempo  para  que  o  gel  não  ferva  e 

transborde  do  erlenmeyer,  até  que  se  obtenha  um  líquido  totalmente translúcido. Aguardar até que esfrie um pouco e pipetar 15 μL de Brometo 

de etídio, homogeneizar, despejar na base para moldagem do gel e inserir os pentes. Aguardar até que o gel se solidifique para remover os pentes e inserir a bandeja na cuba de eletroforese.

 

– CORRIDA DE ELETROFORESE

 

-Colocar  tampão  TBE  1x  na  cuba  de  eletroforese  (aproximadamente  1 litro). 

 -Preparar  papel  parafilme  e  adicionar  2

μL do corante em relação a quantidade da amostra. 
-Adicionar  10μL  da  amostra no  corante e  transferir  para  cada  um  dos poços no gel.

 -Adapta o  eletrodo  (vermelho positivo  deve  ficar  para  onde  o  gel  vai 

correr).

-Ligue  a  voltagem: 

 iniciando  em  80V  e  depois  que  iniciar  a  corrida  subir para 100V, corrida por aproximadamente 45 minutos.

 -visualizar gel em transluminador.