A técnica de sequenciamento consiste num procedimento laboratorial que utiliza métodos bioquímicos com a finalidade de identificar a sequência de bases de nucleotídeos em um DNA. É uma técnica feita por órgãos de pesquisa e os dados são públicos, utilizados para estudar a estrutura e a função dos genes, identificar variantes genéticas e entender como elas podem influenciar os fenótipos. A partir disso, pode-se dar o diagnóstico, o prognóstico ou o tratamento de câncer, doenças genéticas, dentre outros. Ao identificar mutações genéticas a partir da técnica, os médicos podem realizar um tratamento personalizado para o paciente de forma a ser mais eficaz e evitar reações adversas.

1)Método de Sanger: são preparados 4 tubos de reação de sequenciamento que correspondem a cada um dos nucleotídeos. Cada tubo contém o molde do DNA a ser sequenciado, primers, DNA-polimerase, os 4 trifosfatos de didesoxinucleotídeo, um trifosfato de didesoxinucleotídeo marcado por um corante fluorescente radioativo específico para cada tubo e um didesoxinucleotídeo que determina o fim da síntese da fita. Primeiramente extrai-se uma fita de DNA por desnaturação (fita molde), a qual será separada em 4 partes. Adiciona-se então um primer no início de cada uma para que a DNA-polimerase possa agir. Após isso, incorpora-se o didesoxinucleotídeo radioativo e interrompe-se a síntese, fazendo uma mistura de fragmentos de tamanhos distintos que serão separados por eletroforese. Por fim, um filme de raio-x irá identificar a sequência. Esse é o método mais utilizado devido a seu custo benefício. Atualmente o método é automatizado de forma que softwares são utilizados para converter fluorescência em cromatograma. Dessa forma, cada nucleotídeo terá sua cor.

2) Método Pirosequenciamento: esse método determina a ordem de nucleotídeos no DNA a partir da detecção da liberação de pirofosfato na incorporação dos nucleotídeos (sequenciamento por síntese). O DNA molde é imobilizado e a solução contendo os nucleotídeos é adicionada e removida após cada reação, sendo que a luz é produzida apenas quando a solução de nucleotídeos complementa a primeira base sem par da fita molde. A sequência dos sinais quimioluminescentes permite a determinação da sequência dos respectivos nucleotídeos complementares à fita molde.

3) Sequenciamento Ion Torrent: É uma metodologia de alto rendimento que permite o sequenciamento rápido dos pares de bases em amostras de DNA ou RNA. Nele, íons de hidrogênio são liberados quando um nucleotídeo se atribui a uma fita de DNA e sensores detectam essa reação e a alteração de PH.

4) Método Oxford Nanopore: apresentando 99% de confiança, a fita de DNA passa por um poro de proteína capaz de captar sinais elétricos.

Dentre as vantagens do sequenciamento cita-se: possibilitar a escolha do melhor tratamento para o paciente, conhecer as estruturas, funções e regulação do gene para desenvolver novas terapias, diagnósticos pré-natais e pré-sintomáticos de doenças genéticas, rastrear mutações e permitir a elaboração de medicamentos mais precisos.

Dentre as desvantagens tem-se que ainda não exite um catálogo completo dos genes, o aumento no número de abortos seletivos, o uso antiético das informações, o uso social como forma de discriminação e o alto custo.

O Sistema Único de Saúde autoriza a utilização desse método em doenças raras e, em 2020, foi feito um projeto de lei com proposta de realização de testes genéticos para prevenção, diagnóstico e tratamento de cânceres de mama e ovário no SUS.

A eletroforese é uma técnica laboratorial simples, rápida e de grande poder informativo. Dentre suas principais aplicações atuais, destaca-se a determinação e caracterização de moléculas de ácidos nucléicos, tanto DNA como RNA, além de contribuir no campo da genética médica. Dessa forma, as vantagens se tornam muito claras, desde a facilidade na execução até a aplicação da técnica no SUS, como no diagnóstico da anemia falciforme e gamopatias monoclonais, por exemplo.

O gel de agarose envolvido na técnica é um polissacarídeo extraído de diversos gêneros de algas marinhas, que apresenta ampla capacidade de separação de proteínas. Pelo fato de poder ser facilmente preparado no laboratório, torna a técnica prática e de baixo custo, porém chama atenção o poder contaminante que o gel pode causar no meio ambiente, sendo uma característica considerada desvantagem da técnica.

A eletroforese consiste no fracionamento de proteínas presentes em diversos tipos de fluido, levando em consideração suas cargas elétricas e seu peso molecular. A mobilidade eletroforética está diretamente proporcional à carga da partícula e inversamente proporcional à viscosidade do meio.

Em função disso, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras, gerando diferentes bandas, representadas por albumina, globulinas alfa e beta e gama. As frações separadas são observadas a partir de um corante sensível a proteínas.

As moléculas com carga negativa migram para o polo positivo, as moléculas com carga positiva migram para o polo negativo e as que apresentam cargas elétricas equilibradas permanecerão estáticas. Em razão das proteínas serem capazes de adquirirem carga positiva ou negativa em função do pH, é indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo uso de soluções-tampão.

A terapia gênica é um procedimento médico que envolve a modificação genética de células como forma de tratar doenças, a partir da introdução do gene de interesse.

Em doenças causadas por mutações gênicas, a introdução de um gene normal poderá reverter o quadro clínico. Células geneticamente modificadas poderão ativar mecanismos de defesa naturais do organismo, como o sistema imune, ou produzir moléculas de interesse terapêutico.

O gene de interesse é transportado por vetores virais ou não virais.

Algumas das formas de transferência utilizam vírus, sendo o método mais amplamente utilizado, no qual os principais são os retrovírus, os adenovírus e os vírus adeno-associados. A grande imunogenicidade e a expressão gênica transiente relacionadas a estes vetores limitam suas aplicações, ou seja, apresentam riscos associados.

Outras formas de transferência incluem a injeção direta do gene no organismo (microinjeção), assim como métodos utilizando princípios físicos (biolística, eletroporação). A eficiência e reprodutibilidade deste método são muito baixas, acarretando desafios de entrega.

Para terapia gênica no tratamento do câncer o efeito desejável é o de provocar a morte seletiva das células tumorais. Uma das estratégias para a transferência de genes no câncer de mama envolve a reposição do gene supressor de tumor mais comumente alterado nesse caso como o p53.

A terapia gênica é utilizada também em pacientes com HIV, que se trata de um vírus de RNA que utiliza as proteínas CCR5 e CXCR4 como receptor para entrar nas células de defesa como linfócitos T CD4 e macrófagos, e através dessa entrada, multiplicar-se e destruir as células de defesa que geram imunodepressão no paciente. Essa técnica apresenta grande eficácia em editar o genoma, e fazer mudanças direcionadas ao genoma de células vivas, contribuindo para que a proteína CCR5 seja não funcional. Como essa proteína é o sitio primário de ligação do vírus HIV com as células T, sem o receptor exposto na membrana, o vírus não consegue infectar a célula, resultando na diminuição da carga viral e sucedendo a cura ao paciente.

Essa técnica tem avançado seja pela otimização dos tipos de vetores, pela introdução de novas técnicas como as células-tronco pluripotentes induzidas em combinação com modelos atuais de edição gênica (CRISPR-Cas9), até por ensaios em células germinativas, que carregam os aspectos éticos e morais que margeiam a técnica.

A incorporação da terapia gênica no Brasil pelo Ministério da Saúde e a sua disponibilidade pelo SUS ainda não foi solucionada. Pacientes portadores de AME enfrentam ações judiciais para conseguir o tratamento pelo SUS.

Bruna Barroso

Carlos Eduardo Faria

Manuela Pascoal

Maria Eduarda Vieira

Mateus Caixeta

Milena Resende

• Polimorfismo de DNA são variações na sequencial dos nucleotídeos, que não são necessariamente patógenas.

• Existem 3 principais tipos: polimorfismo de nucleotídeo único (troca as bases), ideal A (insere), ideal B (deleção).

• Composto por 7 etapas:

• Isolar o DNA alvo (PCR)

• Digestão (forma 2 extremidades na fita)

• Eletroforese em gel

• Transferência para membrana

• Híbridação

• Detecção

• Análise de resultados

• Utiliza-se a técnica para diferenciação e reconhecimento de microorganismos, genotipagem (identificar cepas), teste de paternidade, identificar restos mortais e mutações, medicina baseada em genômica (eficácia de medicamentos e detecção de variantes que aumentam/diminuem riscos de transtornos)

• Usa-se também para diagnóstico de ANEMIA FALCIFORME, detectando uma alteração gênica de uma base A por T no códon B-hemoglobina (GAG -> GTG: ácido glutãmico -> valina)

• Algumas principais vantagens são que, o meio não influencia e equipamentos necessários estão presentes nos laboratórios. Já as desvantagens, é trabalhosa e necessita de mão de obra qualificada, usa-se grande quantidade de DNA, precisa de sondas específicas para a hibridização e é demorada e cara.

• Usa- se no SUA em exames de HIV, Hepatite C, HPV, Clamídia e Alzheimer.

• Usa- se na rede particular para identificação de micobactérias, hemocromatose, pneumovírus aviário do grupo A e B e pancreatite crônica.

- É o mapeamento de um gene por hibridização molecular de uma sequência de DNA, marcada por fluorescência, num cromossomo espalhado em lâmina. Esse procedimento de hibridização usado para o mapeamento consiste no pareamento entre uma sonda de DNA com fluorescência e o DNA estudado correspondente.

- Nesse pareamento, haverá ligações entre a sonda e a sequência alvo do DNA que serão detectadas pela fluorescência. Para detectá-las, deve ser usado um microscópio epifluorescente.

- É usada para uma hipótese diagnóstica prévia, pois identifica deleções, duplicações ou translocações.

- A técnica tem 11 etapas:

  1) Fixação das Células ou Tecidos

  2) Permeabilização

  3) Marcação das Sondas

  4) Hibridização

  5) Lavagem

  6) Montagem da lâmina

  7) Contrarrótulo

  8) Coloração nuclear

  9) Microscopia de Fluorescência

  10) Captura de imagens

  11) Interpretação

Vantagens:

- Alta eficácia de hibridização e de detecção de anormalidades bem pequenas, sensibilidade e especificidade elevadas, permite a correlação direta entre aspecto citogenético e morfológico, diagnóstico de doenças cromossômicas minuciosas, não depende da fase de metáfase na análise e é uma técnica rápida ofertada pelo SUS.

Desvantagens:

- Utilização de um microscópio específico, necessidade de uma mão de obra especializada e qualificada, exame de alto custo, hipótese diagnóstica prévia e é preciso ter uma sonda sintetizada disponível para determinada anormalidade.

Aplicação do método FISH:

- O FISH pode ser usado para identificar leucemias crônicas (mieloide e linfocítica), câncer de mama (amplificações do HER2 podem ser identificadas pelo FISH), alterações estruturais dos cromossomos (pré-natal) e pode ser usado no processo de fertilização in vitro.

O teste PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma ferramenta crucial na detecção de diversas doenças infecciosas, incluindo COVID-19. Ele envolve a amplificação de material genético específico do patógeno, geralmente o RNA viral no caso do COVID-19. Amostras são coletadas de secreções respiratórias, como swabs nasofaríngeos, e o RNA viral é extraído. Em seguida, ocorre a amplificação do material genético em múltiplos ciclos de aquecimento e resfriamento, permitindo a detecção do vírus, se presente.

As vantagens incluem alta sensibilidade, pois a PCR é capaz de detectar mesmo baixas quantidades de material genético viral, aumentando a precisão diagnóstica; especificidade, pois permite a detecção específica do material genético do vírus, reduzindo a chance de resultados falso-positivos; disponibilidade, visto que com o avanço da tecnologia o teste tornou-se disponível em laboratórios ao redor do mundo; e rapidez, através de novas técnicas, como PCR em tempo real, que permitiu resultados mais rápidos em comparação com métodos tradicionais de cultivo viral.

Por outro lado, as desvantagens incluem o tempo de processamento, que pode resultar em atrasos na obtenção de resultados; custos altos, que inclui equipamentos, reagentes e pessoal treinado, limitando o acesso em algumas regiões; possíveis falsos negativos, em casos de baixa carga viral ou amostragem inadequada, comprometendo a eficácia do diagnóstico e por fim infraestrutura especializada e pessoal treinado, o que pode ser uma limitação em áreas com recursos limitados.

Em suma, o teste PCR se logra muito eficaz na detecção de doenças infecciosas, proporcionando vantagens significativas em termos de sensibilidade e especificidade. No entanto, suas desvantagens, como custo e necessidade de infraestrutura especializada, destacam a importância contínua do desenvolvimento de novas tecnologias de diagnóstico.

A técnica envolve a coleta de amostras de DNA do suposto pai, da criança e, às vezes, da mãe. Essas amostras podem ser coletadas através de swabs bucais ou de saliva. O DNA é então isolado das células coletadas e analisado para identificar marcadores genéticos específicos. A comparação dos perfis genéticos entre o suposto pai e a criança permite determinar a probabilidade de paternidade com alta precisão.

Marcadores com alto nível de polimorfismo, como o DNA minissatélite, são visualizados e especificamente analisados após a eletroforese. A partir disso, é feito a comparação já mencionada, indicando ou não maior probabilidade de parentesco.

As vantagens se baseiam na precisão extremamente alta, geralmente com uma margem de erro muito baixa; na coleta simples e não invasiva, envolvendo na maioria dos casos apenas um swab bucal; na confidencialidade, protegendo a privacidade dos envolvidos; e na resolução de questões legais, como custódia de crianças, pensão alimentícia e herança.

Em contrapartida, as desvantagens incluem o custo relativamente elevado do teste, especialmente se envolverem a participação de laboratórios certificados; a complexidade emocional com relação às partes envolvidas, especialmente se os resultados não forem conforme o esperado; o tempo de espera, podendo levar semanas para os resultados serem concluídos, o que pode ser angustiante para os envolvidos; e ainda assim, possibilidade de resultados inconclusivos, exigindo testes adicionais ou reconsideração dos métodos utilizados.

Apesar de todas as desvantagens citadas, os testes de paternidade oferecem uma maneira confiável de determinar a filiação biológica, fornecendo respostas importantes para questões familiares e legais. Com avanços contínuos na tecnologia genética, espera-se que esses testes se tornem ainda mais precisos e acessíveis no futuro.