In het experiment waarin je de detectiegrens van DNA op agarosegelelektroforese bepaalt, is HinDIII geknipt lambda DNA gebruikt. Hiervan zijn de groottes van de bandjes bekend, het kan dus ook gebruikt worden als referentie (moleculaire gewichtsmarker, of DNA ladder). Maak deze moleculair gewichtsmarker na door restrictie enkeldigestie toe te passen op lambda DNA en analyseer of dit gelukt is. Zorg dat je de correcte buffer gebruikt voor het restrictie enzym HinDIII. Vergeet niet het experiment in silico (digitaal) uit te voeren met NEB cutter om te controleren of je de goede opzet bedacht hebt.

HinDIII is een restrictie enzym, lambda DNA is het DNA van de lambda bacteriofaag.

Bij een restrictie wordt DNA in fragmenten ‘geknipt’. De grootte van de verschillende fragmenten analyseer je op gel.

Voor veiligheid is het belangrijk te weten dat met DNA dye (sybrsafe in dit geval) met de 2-handschoenen methode wordt gewerkt, zoek dit op in de veiligheidsregels.

De voorbereiding van dit experiment staat niet in een filmpje, maar deze week  is in de padlet vaak het antwoord al gegeven (kijk naar de afbeeldingen). Hierdoor zie je wat de bedoeling is en gaat de voorbereiding van de eerste labdag niet te moeizaam. Een planning die je kan maken lijkt verdacht veel op het voorbeeldwerkplan...

Alles wat je voor deze opdracht moet doen kan je als 1 experiment in je labjournaal noteren, ook wanneer er meerdere voorschriften nodig zijn.

Hoe verwacht je dat het resultaat er uit ziet

Welke grootte bandjes verwacht je te vinden? Onderbouw dit met NEBcutter

Agarosegel
______________________0,7_____ % gel
agarose _____________________g
TAE _________________________ ml
eindvolume _________50_____ ml

Dan is de hoeveelheid agarose en TAE makkelijk te berekenen.
0,7% = 0,7 g per 100 ml gel
er is 50 ml nodig, dus 0,35 g agarose
TAE is een buffer (hint: er staat ml in het pipetteerschema), dus aanvullen met TAE tot 50 ml

Het pipettteerschema is dan zoals in de afbeelding

Noteer nog hoeveel ul sybrsafe erbij moet, zonder sybrsafe blijft het DNA in de gel onzichtbaar. Waarschijnlijk is het sybrsafe op het lab 10x verdund i.v.m. veiligheid

Toevoegen aan gel voordat hij gegoten wordt:
puur sybrsafe:                     1 ul of
10x verdund sybrsafe:     10 ul

Reactiemix enkeldigestie HinDIII enzym
                                              1 reactie                   ___ reacties
DNA (1 ug)                                     ___ ul               _____________    
10x RE buffer (welke)                    2 ul                _____________     
Restrictie enzym HinDIII (5U) ___  ul                 _____________   
Demiwater                                   ___  ul                 _____________
Eindvolume                                  20 ul                      _____ ul