• 1 eppendorf p/ cada amostra

• 10 eppendorfs para curva padrão

Plasma: solução salina 0,9% + 100ml H2Od

Proporção - 2 (amostra): 198 (solução salina)

Proporção do BCA Working Reagent

(54+9)x2 x 200 microlitros

Proporção dos reagentes: 50A - 1B

2µl amostra + 198 µl solução salina

Curva padrão albumina = 9

Preparo BCA= 25,200 µl

(54+9)x2x200µl

50A-1B - 24,696µl (A) - 504µl (B)

25µl amostra + 200µl BCAWR

1µl amostra + 97µl do reagente oxidante

Reagente oxidante :

25ml de PBS (tampão)

40µl H2O2 30% (peróxido de hidrogênio)

• Realizar leitura na cubeta

• 1980µl tampão + 20µl amostra

23 amostras = 60ml reagente oxidante na proporção:

25ml PBS + 40µl H2O2 30%

- 60ml PBS + 96µl H2O2 30%

Dosagem da Catalase

25ml PBS + 40µl H2O2 (30%)

Branco 2000µl reagente

23 amostras: 63,98 ml PBS + 102µl H2O2 30%

Fazer branco - 2000µl reagente oxidante

#cell1 - 1980µl reagente + 20µl

Utilizar tampão KPE;

Usar cubeta de quartzo;

Plasma Absoluto

Espectrofotômetro - comprimento de onda 240nm

Tempo - Início 0 - Intervalo: 30s - Duração: 60 s (3 leituras)

Valor de referência: 2ml de tampão KPE

Branco: 2ml de solução B

Amostra:

Tecido: 1800 µl de solução B + 200 µl da amostra - Ler

Plasma: 1980 µl de solução B + 20 µl da amostra - Ler

Solução A - Tampão Fosfato

Solução B - 24,5 ml de tampão + 500 µl de H2O2 (conservar em papel alumínio)

Utilizei:

• KH₂PO₄ (Fosfato monopotássico) - 1,579g

• K₂HPO₄ (Fosfato dipotássico) - 2,334g

• Completar com H₂O(d) (água destilada) até 500ml

--> 0,34ml de peróxido 30% + tampão fosfato até 100ml

Total 48 amostras

• Tampão fosfato para 90ml de H₂O_d pesar 1,224mg KH₂PO₄

• Solução bicarbonato: NaHCO₃ 0,1% (bicarbonato de sódio) para diluir NADPH. 100mg de NaHCO₃ em 100ml de H₂O_d.

•