Nació en Toledo en la cuna de una familia ilustre y pudiente; su padre fue Garcilaso de la Vega y su madre Sancha Guzmán. Se educó en la Corte del rey Carlos I, y se unió a esta a muy corta edad, aprendiendo latín, griego, italiano y francés, al mismo tiempo que se entrenaba en las artes de la esgrima, y aprendía también de música, tocando el laúd, la cítara y el arpa. 

Una vez completada su educación ingresó a la orden de Santiago, muy cerca del rey, como gentilhombre de la Casa de Borgoña, la cuál, junto a la Casa de Castilla, apoyaban a la corona. Hizo parte de varias expediciones militares, una de ellas junto al otro famoso poeta Juan Boscán (quien introdujera con él al idioma español el uso del verso endecasílabo). Con él estuvo en la batalla de Rodas en 1522, un intento de la corona de recuperar el control de la isla, que estaba bajo el control de los otomanes; la isla era la sede de los caballeros de San Juan de Jerusalén y por su localización geográfica un punto muy apetecido. A pesar de los esfuerzos del ejercito, la batalla fue una derrota contundente para el ejercito del rey. A pesar de esto, Garcilaso fue condecorado por su valentía y labor y fue nombrado caballero de Santiago. Como hombre de esta orden sirvió al Duque de Alba.

Garcilaso fue un hombre atractivo y reconocido por la mujeres de las cortes. Se casó con Elena de Zúñiga y tuvo cinco hijos. A pesar de esto tuvo una relación platónica con una dama de origen portugués llamada Isabel Freyre, a quien llamaría Elisa en su versos de amor. Ella se casa con otro y muere joven dando a luz.  Además de los hijos de su matrimonio tuvo otro por fuera de este con Guiomar Carrillo, una mujer de Toledo.

En 1530 Garcilaso viajó con el rey hasta Roma, para acompañarlo en su coronación como emperador de Bolonia. Esta travesía lo llevó además a Bolonia, donde aprendió acerca del uso del endecasílabo. Así le propone a su amigo Juan Boscán introducirlo al idioma español. 

Como parte de su servicio al rey parte a la tercera batalla entre el rey Carlos I y el rey de Francia Francisco I; en el asalto a Provenza Garcilaso es herido de gravedad y trasladado a Niza, donde muere a los pocos días en 1536, con apenas 33 años.