Hoe verwacht je dat het resultaat er uit ziet? 

Als je controles bedacht hebt ga je daar ook verwachtingen bij bedenken
Hoe verwacht je dat controle .... er uit ziet? Onderbouw dit met NEBcutter

Hoe verwacht je dat de negatieve controle er uit ziet? Onderbouw dit met NEBcutter

Hoe verwacht je dat positieve controle 1 er uit ziet? Onderbouw dit met NEBcutter

Hoe verwacht je dat positieve controle 2 er uit ziet? Onderbouw dit met NEBcutter

Bij Restrictie analyse zijn duplo's niet heel nuttig. Het analysemonster hoef je dus niet 2* te maken.

Als je andere nuttige controles kan bedenken dan wat hieronder staat mag je die in je experiment gebruiken. Beschrijf wat je controleert en hoe je de controle maakt / behandelt

Negatieve controle
Met dit monster zie je hoe het experiment er uit ziet wanneer het 'mislukt'. Bij restrictie betekent dat vaak dat de enzymen niet geknipt hebben. Bedenk een monster waarbij je kan zien hoe het resultaat er uit ziet wanneer de enzymen niet geknipt hebben

Positieve controles
Met deze monsters wil je controleren of je gebruikte restrictieenzymen werken. Om zeker te zijn dat het DNA van goede kwaliteit is gebruik je een aangeleverd DNA monster.  Maak per enzym 1 controle.
Denk goed na over de buffer. Wil je weten of het enzym onder ideale omstandigheden kan knippen of wil je weten of het enzym kan knippen in de omstandigheden die je bij dubbeldigestie gebruikt?

Positieve controle 1

Vul in:
Agarosegel, 0,7% gel
agarose _____________________g
TAE _________________________ ml
eindvolume _________50_____ ml

Noteer nog hoeveel ul sybrsafe erbij moet, zonder sybrsafe blijft het DNA in de gel onzichtbaar. Waarschijnlijk is het sybrsafe op het lab 10x verdund i.v.m. veiligheid

Toevoegen aan gel voordat hij gegoten wordt:
puur sybrsafe:                    .... ul, of
10x verdund sybrsafe:     .... ul
_{Images created with biorender.com}

DNA: er wordt per reactie 1 ug DNA geknipt, bereken zelf hoeveel ul DNA er nodig is. 

Analysemonster:
Reactiemix dubbeldigestie ..................  en .................enzym
                                              1 reactie                   ___ reacties
DNA (1 ug)                                     ___ ul               _____________   
10x RE buffer (welke)                    2 ul                _____________     
Restrictie enzym ............... (5U) ___  ul                 _____________ 
Restrictie enzym ............... (5U) ___  ul                 _____________
Demiwater                                   ___  ul                 _____________
Eindvolume                                  20 ul                      _____ ul

Controles:
Reactiemix enkeldigestie .................. enzym
                                              1 reactie                   ___ reacties
DNA (1 ug)                                     ___ ul               _____________    
10x RE buffer (welke)                    2 ul                _____________     
Restrictie enzym HinDIII (5U) ___  ul                 _____________   
Demiwater                                   ___  ul                 _____________
Eindvolume                                  20 ul                      _____ ul

Reactiemix enkeldigestie .................. enzym
                                              1 reactie                   ___ reacties
DNA (1 ug)                                     ___ ul               _____________    
10x RE buffer (welke)                    2 ul                _____________     
Restrictie enzym HinDIII (5U) ___  ul                 _____________   
Demiwater                                   ___  ul                 _____________
Eindvolume                                  20 ul                      _____ ul

In biotechnologie en life science research word soms gebruik gemaakt van plasmides. Dit zijn circulaire stukken DNA waar door middel van knippen en plakken makkelijk genen in te zetten zijn. Het handige aan plasmides is dat ze gemakkelijk in een bacterie te brengen zijn, waarna de bacterie het DNA kan lezen en afschrijven.

Wanneer je een gen in een plasmide wil zetten is het prettig wanneer je niet teveel van het plasmide verliest, in het plasmide zitten nuttige genen zoals antibiotica resistentie. Veel plasmides hebben een multiple cloning site (MCS), een plek waar veel restrictie enzymen kunnen knippen. Door een restrictie uit te voeren met 2 verschillende restrictie enzymen die allebei alleen maar in de MCS knippen kan je het plasmide ‘open’ knippen om een gen in te zetten, zonder dat je belangrijke sequenties van het plasmide kapot maakt en zonder dat het plasmide weer uit zichzelf dichtgeplakt kan worden.

Je supervisor wil een gen inbrengen in het pBINplus plasmide en jij gaat hiervoor het plasmide open knippen met restrictie enzymen. Hiervoor heb je de restrictie enzymen PstI , BamHI, HinDIII, NdEI en fisher restrictie buffers BamHI buffer, O buffer, R buffer en tango buffer ter beschikking. 

Eisen aan resultaten: 
* Plasmide wordt geknipt in 2 fragmenten: een heel groot fragment en een klein reststukje (<100 bp)
* Groot fragment wordt aan beide kanten geknipt met een ander restrictie enzym
* maar een klein fragment van het plasmide gaat verloren

Knip het plasmide open en bedenk controles om te analyseren of het experiment betrouwbaar verlopen is.

Om te controleren of de enzymen werken kan lambda DNA gebruikt worden

Analyseer of de knip gelukt is met agarose gelelectroforese

Met NEBcutter kan je bepalen welke combinatie restrictie enzymen het gewenste resultaat geeft
_{Images created with biorender.com}