• Fenilpropanoid glikosida (PPGs) merupakan senyawa alami yang terdapat pada beberapa tanaman obat yang memiliki daya antioksidan tinggi dan aktivitas biologis yang beragam dan dapat sebagai penanda untuk mendeteksi pemalsuan skullcap dengan germander. Fenilpropanoid glikosida mengandung asam rosmarinat atau asam salvianat, yang merupakan komponen khas skullcap. Selain itu, fenilpropanoid glikosida terdiri dari : 

• 2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl-(6-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside

• calceolarioside B

• osmanthuside E

• martynoside

Dimana keempat senyawa tersebut merupakan senyawa penanda yang tepat untuk digunakan dalam membedakan S. galericulata dengan S. lateriflora.

• Baicalein-7-O-glucuronide, berdasarkan hasil spektra NMR menghasilkan spektra berkisar di 16.501

• Scutellarein-7-O-glucuronide

• Wogonoside

• Baicalein, berdasarkan hasil spektra NMR dihasilkan spektra kisaran 26.372

b. Pemalsuan dengan mengganti genus lain. Pada awal 1990-an, telah dilaporkan adanya penggantian Skullcap menjadi Teucrium (Germander), termasuk Teucrium canadense atau Teucrium chamaedrys yang mengandung diterpen furano neo-clerodane.

c. Perubahan terhadap komposisi struktur kimia pada flavonoid utama dan glikosida fenilpropanoid dapat memberikan efek pemalsuan terhadap senyawa asli (Scutellaria lateriflora). Berikut adalah beberapa contoh untuk senyawa pemalsu lainnya Scutellaria alpina, Scutellaria galericulata, Scutellaria incana, Scutellaria ovata, Scutellaria baicalensis, Teucrium canadense, Teucrium chamaedrys.

1. HPLC

HPLC dapat digunakan sebagai metode analisis kuantitatif yang efisien untuk menganalisis flavonoid. Tujuan melakukan analisis HPLC ini adalah untuk kontrol kualitas, identitas dan keamanan. Prinsip Prinsip dasar metode analisis HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah memisahkan  analit berdasarkan derajat polaritasnya menggunakan dua fase yaitu fase diam (kolom) dan fase gerak (larutan tertentu). HPLC menggunakan tekanan tinggi  untuk mendorong fase gerak. Pelarut pilihan dalam banyak kasus adalah , campuran MeOH-air (dari 6: 4 hingga 8: 2, v/v) atau EtOH-air (6: 4 atau 7: 3, v/v) ), yang akan memberikan ekstraksi flavon-glukuronida yang memadai. 

Cara analisis dengan HPLC 

• Ekstrak dianalisis dengan HPLC menggunakan fase gerak gradien linier 30%-90% metanol/air yang diasamkan dengan asam fosfat, fase stasioner kolom silika C18, dan deteksi puncak flavonoid dengan UV pada 280 nm. 

• Kuantifikasi total flavonoid didasarkan pada luas puncak senyawa referensi kerja, krisin, yang awalnya dikalibrasi terhadap standar baicalin. Faktor respons yang sama diasumsikan berlaku untuk semua flavonoid. 

• Nilai ditentukan berdasarkan berat kering dengan kandungan air sampel kering ditentukan dengan pengeringan vakum.

2. Direct MS

Metode MS merupakan metode standar terbanyak yang digunakan di laboratorium yang mampu mendeteksi sejumlah kecil adulterant, dapat digunakan untuk kualitatif dan kuantitatif. Metode MS ini mampu memberikan jawaban “ya” atau “tidak” tanpa campur tangan analis. Analis dibutuhkan untuk mengatur parameter instrumennya, evaluasi statistik, dan untuk menjalankan instrumen. Kekurangan analisis menggunakan MS adalah waktu sonikasi 1 jam dan volume sampel kecil mengharuskan ekstraksi pada suhu tinggi serta dapat meningkatkan risiko degradasi. 

3. NMR

Metode NMR memiliki kelebihan seperti waktu analisis yang singkat, pelarut yang digunakan tidak banyak, dapat diandalkan, statistik tercanggih, dapat digunakan untuk kualitatif dan kuantitatif.  Hasil NMR mampu membedakan S. lateriflora dengan jelas dari sampel Teucrium dan instrumen akan memberikan jawaban “ya” atau “tidak”. Prinsip metode NMR adalah dengan membandingkan antara spektrum sampel yang dihasilkan dengan spektrum referensi dari skullcap yang otentik, sehingga dapat diidentifikasi apakah ada perbedaan atau tidak.

Mikroskopi merupakan metode yang paling mudah untuk mendeteksi adanya pemalsuan dengan menggunakan bahan inert dan bahan pengisi (misalnya selulosa, pati, dan pasir). Dalam autentikasi atau deteksi pemalsuan, uji mikroskopis harus dikombinasikan dengan metode lain yang sesuai, misalnya dengan uji genetik. Kelebihan dari metode ini diantaranya cepat, murah, dapat dengan mudah mendeteksikan pemalsuan dari spesies Teucrium. Namun, kekurangannya yaitu metode ini tidak dapat digunakan untuk identifikasi ekstrak dari S. lateriflora secara spesifik, tidak ada otomatisasi/statistik, dan hasil yang diperoleh bergantung dengan keahlian dari analis. 

b) Genetik

Metode genetik tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi bagian dari tanaman yang diuji, termasuk S. lateriflora. Oleh karena itu, pengujian genetik biasanya harus digabungkan dengan uji lain yang sesuai agar dapat membedakan bagian tanaman. Hal ini disebabkan metode DNA biasanya tidak tepat dan tidak dapat diandalkan untuk pengujian identitas ekstrak atau bahan olahan tertentu. Namun, metode ini juga memiliki beberapa kelebihan yaitu mampu mendeteksi sejumlah kecil dari pemalsuan.

HPTLC merupakan metode analisis kimia yang digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi senyawa dalam sampel. Dalam HPTLC, sampel ditempatkan pada suatu lapisan tipis bahan penyerap (biasanya silika atau alumina) yang diterapkan pada suatu plat atau kaca kemudian plat tersebut kromatografi dengan menggunakan pelarut tertentu untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam sampel.

HPTLC digunakan untuk menganalisis komponen-komponen dalam material mentah dan ekstrak Pada HPTLC Digunakan metanol sebagai pelarut ekstraksi akan memperpendek waktu aplikasi (metanol lebih cepat kering daripada larutan etanol 70% berair) dan dapat menghasilkan pita yang lebih seragam.

Penelitian oleh Hong et al. berhasil mendeteksi sebanyak 0,5% T. chamaedrys dalam S. baicalensis menggunakan kondisi HPTLC dengan memodifikasi sistem pelarut untuk mencakup kondisi yang sesuai untuk komponen yang kurang polar. Modifikasi ini mengakibatkan resolusi yang lebih rendah antara flavon-glukuronida yang melimpah dalam S. baicalensis dan glikosida fenilpropanoid dalam Teucrium.

Kelebihan dari HPTLC yaitu cepat, tingkat akurasi dan presisi tinggi, sistem dasar yang terjangkau untuk laboratorium yang lebih kecil, dan mampu mendeteksi jumlah kecil bahan pencemar. Kekurangan  dari HPTLC yaitu tidak terdapat statistik, mahal, membutuhkan senyawa standar, dan pengoperasian alat cukup rumit.

d) HPLC-UV (High-Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet Detection) 

HPLC-UV merupakan metode yang digunakan dalam proses pemisahan dan deteksi senyawa dalam sampel menggunakan teknik kromatografi cair berkinerja tinggi dengan deteksi ultraviolet. HPLC-UV digunakan untuk menganalisis komponen-komponen dalam material mentah dan ekstrak. Pada metode ini, persiapan sampel memakan waktu cukup lama selama proses analisis. Pelarut yang sering digunakan adalah campuran MeOH-air (antara 6:4 dan 8:2, v/v) atau EtOH-air (6:4 atau 7:3, v/v), yang akan memberikan ekstraksi yang memadai dari flavon-glukuronida.

Metode ini memiliki beberapa kelebihan, yakni peralatan standar yang banyak terdapat di laboratorium, dapat mendeteksi dalam jumlah kecil bahan pencemar, dan sebagian besar bersifat kuantitatif (kurang spesifik dibandingkan HPLC-UV/MS). Lalu, kekurangan dari metode ini, yakni peralatan mahal, seringkali tidak diterapkan statistik (meskipun perangkat lunak tersedia), dan membutuhkan senyawa standar

MS-Fingerprinting dapat digunakan untuk mengidentifikasi adulterasi secara kualitatif dan kuantitatif. Metode ini merupakan metode autentikasi berbasis statistika yang cepat dan ramah lingkungan karena menggunakan pelarut yang rendah. MS-Fingerprinting akan mengidentifikasi sampel dengan memberikan jawaban “ya” atau “tidak” yang dibandingkan dengan pustaka bahan autentikasi. Seorang analis perlu mengatur parameter instrumen dan evaluasi statistik, sebelum menjalankan instrumen. Alat ini sangat mahal dan memiliki risiko degradasi yang tinggi karena diperlukan sonikasi selama 1 jam dan volume sampel kecil yang dapat menyebabkan ekstraksi temperatur tinggi. Jumlah sampel yang digunakan sangat kecil sehingga menjadi salah satu faktor mengapa metode ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi adulterasi. Namun, metode ini belum divalidasi dan tidak ada parameter kesesuaian sistem.

f) NIR-HSI

NIR-HSI adalah metode yang cepat, ramah lingkungan, tidak merusak, terjangkau, memiliki selektivitas yang tinggi dan sensitivitas yang rendah dibanding kromatografi konvensional. Sampel bahan mentah, ekstrak, atau bahkan bahan dalam matriks heterogen dapat dianalisis dengan sedikit atau tanpa pra-pemrosesan. Metode HSI dapat menganalisis sampel dengan jumlah besar sehingga menghindari kesalahan pengambilan sampel. Sandasi dkk. melakukan analisis statistik multivariat pada gambar hipersprektral untuk membedakan ketiga spesies yang dianalisis (S. lateriflora, T. canadense, dan T. chamaedrys) dengan menggunakan pendekatan metode statistik sehingga diperoleh jawaban “ya” atau “tidak” tanpa bergantung pada interpretasi seorang ahli. Metode ini hanya dapat mendeteksi campuran dengan Teucrium spp. pada kadar ≥ 40%. Hal ini karena kesalahan deteksi (deviasi antara nilai pasti dan prediksi) menjadi lebih besar seiring dengan persentase adulterasi/pemalsuan.

Counterfeiters might falsely label a product as "100% pure tea tree oil" when, in reality, it contains other ingredients. This deceptive labeling misleads consumers who seek the specific benefits associated with pure tea tree oil.

3. Quality and Origin Misrepresentation: Sometimes, tea tree oil is sourced from different regions with varying quality. Counterfeiters might misrepresent the oil's origin or quality to command higher prices or create an illusion of premium quality.

4. Use of Synthetic Compounds: In some cases, counterfeiters may produce synthetic compounds that mimic the aroma of tea tree oil. This synthetic version is then passed off as genuine tea tree oil.

To steer clear of fake tea tree oil, buyers should buy from trustworthy vendors, meticulously examine product labels, and exercise caution with offers that appear exceptionally advantageous. Third-party testing and certifications can also serve as signs of an authentic and superior-quality product

Have a yellow color, not very soluble in water and ether but soluble in organic solvent such as ethanol and glacial acetic acid. Stable at high temperature and in acidic environment but is sensitive to light.

2. Purity Test: Examines the oil's cleanliness and purity, as well as looking for unwelcome impurities.

3.microbiological testing: Establishes the product's microbiological cleanliness level to guarantee safe usage.

4.Determining Moisture Content: This process ascertains the water content of essential oils to guarantee their stability and purity.

5.Aroma Test: Assesses the scent qualities that Melaleuca Alternifolia oil produces.

6.Pesticide Residue Testing: Verifies the cleanliness and safety of products by looking for pesticide residue.

7.Compliance with Industry Standards: Adhere to relevant industry standards, including ISO or regional norms, for essential oils.

(Farmaceutická Fakulta UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE, 2020).

• LC-MS used in an adulteration test for extract.

  • The separation process as well as the identification process of the various compounds which are structurally similar can be identified; this serves as one of the most superior qualitative tools among the various tools for the analysis of different herbs and the adulterants. (Mannur and Balankundri, 2020).

  • With the advances of the LC-MS technique, the screening and characterization of the adulterants (unknown and known) which are novel analog can also be detected and identified by applying this technique in the quality control of the materials. (Mannur and Balankundri, 2020)

• HPLC for testing active substance content

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) is one of the most efficient methods to quantify active compounds. Price-wise, the instrument itself is not cheap. But when it comes to routine analysis, it is the better choice as it is a versatile and easy method. Especially when we’re talking about long-term investment. 

• Water content

Bilberries water activity can be measured using an instrument called the AquaLab 4TE, for a reliable result, the test can be done in 3x.  While for the water content, it can be determined by weighing about 2 grams of powder and drying it in a vacuum oven at 70°C and 90 kPa until constant weight is reached, it can be concluded by calculating the weight percentage difference between tests until it results in <0.25% (Eliasson et al., 2019).

• Ash content analysis

Looking at the nutritional value and levels of toxic minerals in the extract.

• Flowability

The flowability of bilberry powder can be measured using a powder flow tester and expressed as the powder flow function. The flowability was classified into five categories based on the flow factor index (ff): nonflowing: ff <1, very cohesive: 1<ff<2, cohesive: 2<ff<4, easy-flowing: 4<ff<10, and free-flowing: 10<ff (Schulze, 2008).

• Microorganism test

The number of microorganisms in a pharmaceutical product can be tested using total plate count method.

• Active substance content

Although rare, the sale of "bilberry" fruit extract in large quantities containing spinach dye also falls into this category. This type of forgery is intended to deceive tests determining the total anthocyanin content using UV/vis spectrophotometry.

The most common method used by forgers to exploit the lack of specificity in UV/vis methods is partial or complete substitution with lower-cost extracts containing similar constituents. An example is the forgery of bilberry extract with extracts from other plants rich in anthocyanins, such as blueberry species (V. angustifolium, V. corymbosum, V. floribundum, Ericaceae), wild cherry (Prunus avium, Rosaceae), black chokeberry (Aronia melanocarpa, Rosaceae), European elderberry, black soybean hulls (Glycine max, Fabaceae), black rice (Oryza sativa, Poaceae), mulberry fruit (Morus australis, M. nigra, Moraceae), and others. Although the prices of these fruit derivatives are relatively high (compared to commodity prices such as black soybeans and black rice, which are consistently lower), these fruits are still available at lower prices compared to bilberry.