Placa 02(superior direito) : Ágar MacConkey, MC(Amostra 2, A2)

Placa 03(inferior esquerdo) : Ágar CLED(Amostra 2, A2)

Placa 04(inferior esquerdo) : Ágar CLED(Amostra 1, A1)

A coprocultura é uma técnica qualitativa que determina agentes bacteriano em gastroenterite em adultos e normalmente é recomendada e utilizada como exame complementar com exame parasitológico de fezes.

Para realizar a coleta da amostra da porção orofaringe, um dos estudantes se voluntariou para doar a amostra, enquanto outro devidamente orientado pela professora realizou a coleta. Este foi orientado a posicionar o estudante confortavelmente, sentado com a cabeça levemente inclinada para trás e apoiada na parede.

Após o estudante ser orientado a abrir bem a boca e a falar continuamente a letra “A”, foi utilizado um abaixador de língua para auxiliar na visualização do local em que se desejou coletar a amostra e impedir que o paciente interfira na coleta com o movimento da língua.

Após isso, foi utilizado o swab, pressionando e rolando no local desejado, evitando outros sítios da cavidade oral, como a língua ou mucosa bucal. 

Por fim, o swab foi emergido em recipiente estério contendo solução salina.

além de permitir a separação das mesmas através da morfologia (cocos, bacilos) e do arranjo (em cadeia, cachos, aos pares, etc.).

- Identificação de Cocos Gram Positivos

Coloração de Gram

Inicialmente, antes de iniciar os procedimentos, as placas contendo os meios de cultura foram postos próximos à lamparina acesa. Com a alça bacteriológica flambada corretamente, foram coletadas uma pequena quantidade da solução salina (2 a 3 gotas) e depositada sobre a lâmina para microscopia.

Logo depois, a alça bacteriológica foi novamente flambada e esfriada, e com a placa próxima a chama da lamparina, foi coletada uma das colônias isoladas do meio de cultura. A colônia foi então diluída com as gotas da solução salina anteriormente depositada na lâmina, realizando o esfregaço. Posteriormente, para fixar o esfregaço, passou-se a lâmina rapidamente algumas vezes sobre a chama da lamparina.

Para a coloração, utilizou-se os 4 reagentes utilizados, na seguinte ordem:

• O corante primário Cristal Violeta durante 1 minutos, descartando-o na pia após o tempo determinado;

• A substância fixadora Lugol durante 1 minuto, descartando-o na pia após o tempo determinado;

• O solvente orgânico Álcool, pigando algumas gotas na lateral da lâmina para escorrer sobre o esfregaço até parar de sair o corante;

• E o corante secundário Fucsina, por 30 segundos, descartando-o na pia após o tempo determinado.

Por fim, foi utilizado um filete de água da torneira sobre as laterais da lâmina para escorrer o corante. Deixou-se a lâmina secar por um período de tempo, e após isso foi observado ao microscópio na objetiva de 100x.

Após o período de incubação, foram analisadas as placas e houve crescimento nas 3 placas. Nas placas de Salmonella-Shigella, e EMB, foram observadas colônias muito escuras e na placa de MC, colônias levemente escuras. Os pontos pretos observados no meio S.S indicam a formação de sulfeto de hidrogênio, que é formado quando as bactérias produzem tiossulfato redutase que reage com tiossulfato de Na. Essa observação também é uma indicativa de fermentadores de glicose, que nos leva a suspeitar de uma enterobactéria.

• Tira de oxidase.

b- Com o auxílio de uma alça de platina, foi transferido assepticamente uma ou duas colônias da bactéria em análise (a bactéria que apresentou crescimento e resultado positivo no meio ágar CLED);

c- Em seguida, a amostra coletada, foi espalhada sobre a superfície da área reagente da tira;

d- O resultado foi observado em até 2 minutos;

Logo, a partir do resultado de oxidase negativa, podemos constatar que, a bactéria analisada não possui a enzima citocromo oxidase, sendo assim, a bactéria pertence a família de Enterobacteriaceae (oxidase negativa).

De acordo os resultados obtidos durante a prática e a partir dos procedimentos realizados, foi possível observar pela microscopia que se tratava de uma bactéria Gram-positiva, devido a sua coloração azul/roxo, característico dessas bactérias. Por este método, também foi possível observar através da sua morfologia e arranjo, e classificá-la como cocos agrupados em cachos.

Logo, de acordo essas características obtidas (cocos Gram positivos), pode se tratar de bactérias das espécies estafilococos, estreptococos ou enterococos.

As enterobactérias representam 80% ou mais de todos os Gram negativos de importância clínica isolados na rotina microbiológica. As enterobactérias que atualmente predominam em infecções hospitalares são Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp. (90%) seguidos de Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp.

O sistema proposto pela Laborclin em seu Kit para detecção de Enterobactérias, utiliza 5 meios de cultura que fornecem 10 provas bioquímicas, que associadas à leitura da fermentação da lactose (proveniente do meio de isolamento) permitem uma identificação segura da bactéria analisada.

• Kit Enterobactérias laborclin (5 meios de cultura);

• Manual para identificação impresso.

• Meio VM - VP;

• Reativo de Kovac’s;

• Vermelho de metila.

b- Usando a mesma agulha do tubo anterior, a amostra foi inoculada no tubo 2 por picada central até o fundo, e logo após, o tubo foi fechado;

c- Usando a mesma agulha do tubo anterior, a amostra foi inoculada no tubo 3 por picada central até o fundo, cuidando para que ao voltar, a agulha seguisse o mesmo trajeto (para não criar dificuldades na prova da motilidade), em seguida o tubo foi fechado;

d- A agulha foi flambada e encostada na mesma colônia, semeando o tubo 4 na superfície, cobrindo-o com vaselina estéril (para garantir ambiente anaeróbio), e fechando o tubo em seguida;

e- A agulha foi flambada e encostada novamente na mesma colônia, semeando a superfície do tubo 5, cuidando para que não haja excesso de inóculo, e fechando o tubo a seguir;

PROVAS COMPLEMENTARES

Cada grupo ficou responsável pelo inóculo de cada uma das amostras, sendo estas, amostras 1, 2 e 3, logo foi realizado o seguinte procedimento para cada amostra:

f- Com o auxilio da agulha de platina flambada, a mesma foi encostada na superfície da colônia da amostra e inoculada no tubo contendo ágar inclinado, por picada central até o fundo do tubo, e ao voltar a agulha, foi realizada a semeadura por estrias na superfície inclinada do meio, em seguida o tubo foi fechado;

g- Com o auxilio da agulha de platina flambada, a mesma foi encostada na superfície da colônia da amostra e inoculada no tubo com meio VM-VP, por meio da homogeneização da amostra no meio líquido, em seguida o tubo foi fechado;

h- Por fim, foi incubada a bateria de tubos em estufa bacteriológica entre 35 a 37oC/18 a 24h e os resultados observados.

• Desaminação do L-Triptofano: foi observado que as amostras 1 e 3 possuem resultados negativos para a desaminação do L-Triptofano, enquanto a amostra 2 apresentou resultado positivo, visto que, o resultado positivo desse teste é caracterizado pela coloração verde garrafa no ápice da parte inclinada. Sendo assim, o teste indica que a bactéria analisada na amostra 2 produz a enzima L-triptofano-desaminase que provoca a desaminação do L-triptofano, resultando na sua conversão à alfa-cetoácidos. Formando ácido indol pirúvico que reage com sais de Fe, originando um composto cíclico de cor verde escura na superfície do meio inclinado. Ademais, os resultados negativos sugerem que as bactérias 1 e 3 não produzem a enzima L-triptofano-desaminase.

• Fermentação da glicose: Não foram determinados resultados positivos ou negativos para ambas as amostras, pois a coloração do meio devido a formação de H2S, impediu a visualização do resultado. Porém, nesse teste o resultado é positivo quando há o desenvolvimento de uma cor amarela no fundo do tubo, e o resultado é negativo quando o fundo do tubo mantém a cor original do meio (verde azulado).

• Produção de gás a partir da glicose: foi observado que a amostra 2 tem resultado negativo para a produção de gás a partir da glicose, enquanto as amostras 1 e 3 apresentaram resultados positivos, visto que, o resultado positivo desse teste é caracterizado pela presença de bolhas ou rachaduras no meio. Sendo assim, o teste indica que as bactérias analisadas nas amostras 1 e 3, fermentam glicose com produção de ácido fórmico, logo, a enzima formiase converte o ácido fórmico em CO2, ocasionando a geração de bolhas no meio. Ademais, o resultado negativo sugere que a bactéria 2 não fermentam glicose com produção de ácido fórmico.

• Produção de gás sulfídrico: foi observado que a amostra 1 tem resultado negativo para a produção de gás sulfídrico, enquanto as amostras 2 e 3 apresentaram resultados positivos, visto que, o resultado positivo desse teste é caracterizado pelo desenvolvimento de cor negra de intensidade variável no fundo do tubo. Sendo assim, o teste indica que as bactérias analisadas nas amostras 2 e 3, produzem a enzima tiossulfato redutase que catalisa a reação de conversão do tiossulfato a H2S. Em seguida, o H2S reage com íons Fe3+ presentes no citrato de ferro amoniacal, levando a formação de sulfeto de ferro (precipitado negro). Ademais, o resultado negativo sugere que a bactéria 1 não produz a enzima tiossulfato redutase e consequentemente, não ocorre a conversão do tiossulfato a H2S.

• Hidrólise da uréia: foi observado que as amostras 1 e 3 possuem resultados negativos para a hidrólise da ureia, enquanto a amostra 2 apresentou resultado positivo, visto que, o resultado positivo desse teste é caracterizado pelo desenvolvimento de coloração azul na base do tubo, que pode mascarar a leitura da prova da glicose, ou pode estar mascarada quando a bactéria produz, concomitantemente, H2S. Sendo assim, o teste indica que a bactéria analisada na amostra 2 produz a enzima urease que catalisa a reação de degradação da uréia, obtendo como produto final o hidróxido de amônio, alcalinizando o meio, levando a mudança de coloração. Ademais, os resultados negativos sugerem que as bactérias 1 e 3 não produzem a enzima urease e consequentemente não há a degradação da ureia.

Para realizar a identificação correta, é realizado sistematicamente um processo laboratorial em que permeia desde a coleta do material até a identificação do microrganismo, através da análise dos dados obtidos.

• Descarboxilação da lisina: Foi observado que as amostras 1 e 3 possuem resultados positivos para descarboxilação da lisina, devido a coloração púrpura no meio; já a amostra 2 se apresenta com resultado negativo, devido ao desenvolvimento da coloração amarela no meio. Desse modo, o teste indica que a bactéria dos tubos 1 e 3 contém a enzima carboxilase, onde há liberação de CO2 e descarboxilação da lisina na produção da respectiva amina (cadaverina), esta neutraliza os ácidos produzidos na fermentação da glicose, alcalinizando o meio e proporcionando a viragem do indicador de pH (o meio muda de amarelo para púrpura, novamente).

• Descarboxilação da ornitina (ORN): Foi observado que os três tubos se apresentaram positivo para a descarboxilação da ornitina, visto que houve o desenvolvimento da coloração que passa do amarelo ao púrpura no meio. Sendo assim, podemos perceber que a bactéria do tubo 1,2 e 3 possuem a capacidade de utilizar as enzimas carboxilases com substrato específico, que por sua vez é capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminoácidos para formarem aminas alcalinas. Essa reação, conhecida como descarboxilação, origina dióxido de carbono como produto secundário. A citrulina é convertida em ornitina, que sofre descarboxilação para formar putrescina, verificando a capacidade do micro-organismo utilizar a enzima, auxiliando na identificação

• Motilidade (MOT): Para o teste de motilidade, foi observado que os tubos 1 , 2 e 3 são positivos, devido ao crescimento difuso com turvação total ou parcial do meio. Desse modo, sabe-se que a bactéria do tubo 1, 2 e 3 são bactérias móveis, pois as mesmas quando sameadas em meio semissólido difundem-se no meio, turvando-o .

• Indol (IND): Já no teste do indol, foi possível perceber que apenas o tubo 1 obteve resultado positivo, sendo 2 e 3 negativos. No tubo 1 é notável o surgimento de um anel vermelho, após adicionar 2-4 gotas do reativo de Kovac’s sobre a superfície do meio e aguardar cerca de dois minutos. Com isso, podemos perceber que a bactéria presente no tubo 1, possui a ação da enzima Triptofanase através da degradação do Triptofanase em Indol.

• Rhamnose (RHA): Diante do resultado podemos perceber que os tubos 1 e 3 são positivos para o teste de Rhamnose, sendo o tubo 2 negativo, isso se da devido ao desenvolvimento de uma coloração amarela com turvação do meio para os tubos positivos e no tubo 2, sendo ele negativo, o meio mantém sua coloração original e com crescimento (turvação). Através desse resultado, conseguimos identificar que a bactéria presente no tubo 1 e 3 possuem a capacidade de fermentar Ramnose.

• Citrato (CIT): Podemos observar que os tubos 2 e 3 são positivos para o teste de citrato, enquanto o tubo 1 é negativo. Observa-se esse resultado, levando em consideração que para um resultado positivo, observa-se crescimento no meio e/ou desenvolvimento de coloração azul (como observado nos tubos 2 e 3), já o negativo a coloração do meio se mantém inalterada e sem sinais de crescimento (como observado no tubo 1). Com isso, podemos concluir que a bactéria do tubo 2 e 3 utilizam citrato de sódio como única fonte de carbono e nitrogênio para a produção de energia.

Desta forma, é possível classificá-lo como da espécie Staphilococcus spp, pela sua capacidade de produzir a enzima catalase que degrada o peróxido de hidrogênio (H2O2), formando bolhas ou gás.

• Com a utilização de alça bacteriológica, foi transferido parte de uma colônia para a lâmina;

• Depois, adicionou-se uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%, e observou se houve a formação de bolhas;

• Para esse teste foi utilizado uma solução de microrganismos em caldo, obtendo uma suspensão turva;

• Utilizando um swab, parte da suspensão bacteriana foi sobre a metade de uma placa de ágar sangue;

  3. Com o auxílio de uma pinça flambada, foi adicionado um disco de novobiocina sobre a área semeada, sendo este pressionado com a pinça para aderir à superfície do ágar;

  4. A placa foi incubada a 35-37°C por 18 a 24 horas.

• Agar Fenilalanina: Diante do resultado obtido, podemos perceber que apenas o tubo 2 é positivo para o teste, sendo os tubos 1 e 3 negativos. Sendo assim, a bactéria presente no tubo 2 possui a enzima necessária para a desaminação de fenilalanina.

• Vermelho de Metila: Podemos observar que os tubos 1, 2 e 3 são positivos para o teste de VM, ou seja, a bactéria presente nestes tubos possuem a capacidade de produzir elevadas taxas de produtos ácidos por intermédio da fermentação da glicose.

• Voges Proskauer: Já para o teste de VP, os tubos 1, 2 e 3 são todos negativos, sendo assim, as bactérias presentes nestes tubos não realizam fermentação por via butilenoglicólica.

Amostra 1 : E. Coli

Amostra 2 : Proteus mirabillis

Amostra 3 : Salmonella