2. 課堂開始前，學生聽眾要留言comments。

3. 課堂中，每位學生必須要問問題。每位同學提出的問題及得到的答案必須貼在板上，期限為上課當天。

4. 學生聽眾貼在板上的問題及答案的質與量為學生聽眾提出問題的分數，答案的正確與否為講者回答問題的分數，所以講者在一周內適當提出修正及補充學生聽眾貼在板上的答案。

Q：在第二十頁投影片中的公式意義為何？以及與F-mutant/ DF-mutant+peptide速率的關係為何要用比值做比較？

A：公式中分母的部分為那個docking location的體積，分子為40多萬組模型目標位點在此磷酸化的機率。

因為用比值可以作為population的表示，而如果用差值作比較容易失真。

Q: D-motif and F-motif 功能上有什麼不同？

A: Biological 上並沒有研究解釋功能上的不同，主要功能就是docking 。

A: 作者在文中沒有提到，不過可能是JNK1上的FRS( F-motif recruitment site)本身和JIP1的binding affinity不高 (F-motif對JNK1的binding affinity, Kd值約2.2mM，遠低於D-motif, Kd值約81nM)，加上F-motif主要促進的是其鄰近（特別是立刻N端附近，如T205）的磷酸化，作用範圍比D-motif窄，對整體磷酸化的模式影響有限。此外JIPI內的F motif沒有phenylalanine，使其docking上JNK1的效率不高。

A:不偏好N端可能是因為結構上的問題，雖然是IDR，但還是會有side chain會影響到IDR的結構，導致N端不偏好進入active site。

A：因為FRS與F-motif的Binding本身就較弱。FRS的功用是與DRS協同作用，使JNK1更容易使JIP1磷酸化。

A:應該跟結構沒關係，可能是因為 mutate D motif ,讓 JNK 的 docking site DRS 空出來,跟 JIP 其他位點形成hydrophbic cluster interaction ,而意外造成這三個位點磷酸化比例提高。

A：從Fig.1 D圖中，可看到S421磷酸化效率本來就低，因此Fig.3圖上表示加入peptide後與wild type有差距，其實此差距是很小的。

Q: 所以可以透過這篇paper進而解釋說D-motif的影響具有距離和方向性，而F-motif則僅促進N端的單一位點嗎？

A: 只有在此篇paper可以這樣解釋，在此篇paper中是這樣沒錯。

A:我推測是根據胺基酸的性質做分類，例如是否帶電，極性非極性等，講者說明會回去再確認。

Q:想問在NMR的圖中其實有顯示13個點 但這邊主要提到的是11的點，那其他兩個點是跟JNK1的磷酸化比較無關嗎？

A:文中有提到多看到兩個點，分別是S40跟T201，他們鑑定到這兩個是非典型的磷酸位點，不是S/T-P site 的磷酸化位點，這篇作者雖然有提到這兩個點，可是沒有在後續進行更多的探討，所以我們沒有特別說明。

Q: 測定phosphorylation rate時X軸皆為40分鐘，請問是如何界定出來的呢？還是NMR測定時間以40分鐘為單位？

Ａ：NMR並不是以40分鐘為單位測量，而是有些組別在40分鐘時已達飽和且拉開差距。

Q：為了阻斷在阻擋D motif後其他位點有結合力增強的現象做了一條peptide，想問那條peptide是怎麼設計的？

A：直接設計一個可以把D motif直接整塊擋住的peptide

Q:如何區分Fig 1F中的adjenct cell和 tumor cell?

A:應該有做另一份明視野H&E stain的切片，來去確認二者的位置！

Q：M1/M2 macrophage的差異？

A：M1,抗發炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、促進發炎，

M2,抑制發炎、組織修復、促進腫瘤、免疫抑制，

單核細胞是巨噬細胞的來源，巨噬細胞可以分成不同的類型，會有不同的功能，但都具有巨噬細胞的marker。

A : 推測應該是用CAR-T做治療前就已經有開始根據小鼠的各種狀態去計算分數，然後第0天則是開始加入CAR-T的時間。

A:放約14天後，根據腫瘤的大小判斷（有一個criteria量表）

A: Macrophage 的M1及M2都有不同的subtype，不同的subtype 所 secret 的 cytokine也有所不同，導致結果只看到IL-6及IL-12是有顯著差異的。

A: Supplemental figure 2中，作者依據Weigh loss, Activity, Paralysis來給予分數，分數越高代表嚴重程度越高。

A:因淋巴瘤可能會局部生長，也有可能隨著疾病進展擴散到其他地方，因此作者建立全身性和區域性的小鼠模型（兩者感染方式不同，全身性為靜脈注射，區域性為皮下注射），可能造成免疫反應不同，並了解在CAR-T 治療下 TAM 是否存在差異。

A：在黑線中，有用流式細胞儀去做染色的動作，那上面的區塊是有測量到被染色，是有螢光表達的地方，下面的區塊就是沒有表達的地方。一般會做一個control組沒有染色的部分去界定說哪一區是有表達，哪一區是沒有表達，之後再去確認中間那一條黑線會畫在哪裡

A：當細胞激素與受體結合後會活化下游的STAT路徑，接著影響DNA的表達，使之朝向M1/M2極化

Ａ：在小鼠皮下原位腫瘤實驗裡，常用卡尺測量腫瘤的長徑 (a, length) 與 短徑 (b, width)。由於腫瘤大致呈橢圓形，腫瘤體積公式 a × b² / 2 是從橢球體體積公式推導來的。

Q: figure 2B有說是分別沒植入CAR-T和有植入CAR-T的小鼠復發的機率，想問右邊那張圖橫軸是什麼意思？

A: 就是在所有CAR-T小鼠中復發和痊癒的比率

Q: mother centriole 跟 primary cilia 的關係？

A: mother centriole會有一群裡面含有很多組裝cilia的component的囊泡會接在上面，然後會形成cilia，等他長到一定的長度之後外膜會和細胞膜融合長出去

Q：Fig 2I中，scramble 的意義是什麼？是代表 control嗎？

A：他是具random sequence 的質體，且當其進入細胞時不會影響細胞，因此可作為control 組。

A:作者內文的描述認為染到 alpha -Tublin 的確都是 sinc-MTs ，但是至於會不會染到其他的 tublin 可能要再回去看 supplementary。

A: 因為sinc-MT為受到壓力後短暫的形成，KIFC3只會在有polyglutamylation的mircotubule上協助移動。因此當sinc-MT隨著時間增加而不見時，KIFC3也會不在，所以看不到螢光訊號。

A: cilia可以作為一個溝通的橋樑，感應外界的刺激，接著把訊號傳遞下去，其中有跟衰老相關的路徑

A:KIFC3-v5是設計帶有v5 tag 的exogenous protein ，所用IF抗體則是標記在v5 tag上。

A: p-Rb是磷酸化的Rb，其磷酸化後被抑制。因此在stress前表達p-Rb，stress後表達活化老化因子Rb。

Q:如何判斷Fig 3e的圖是細胞核還是整顆細胞?

A:由染成紅色的polyglutamylated sinc-M呈線狀可以判斷應為整顆細胞，若為細胞核應會呈點狀。

答:我有去看說明，但作者沒有特別說，因此我猜測是做二重複，或是其他sh 的knockdown的RNA 序列不一樣，但沒有很清楚。

A1:CDK5RAP2與微管的形成和調節有關，且會去影響到p21及p16的衰老因子

Ａ:CAMSAP2是一種protein，本篇文章用帶有螢光的專門抗體進行染色。

A:在p53下游，受p53調控的基因

A: 因為 USP53 和 USP54 序列相似，所以作者才一起做 。

Q:為什麼Fig1F中的結果可以得出di-Ub不容易被切除？

A:實際上這裡只能得出Ub會被USP53 54切除，但是若要得出di-Ub被切除要結合後續實驗的結果才能得出。

A: 一段特定的結構，會專一性binding ubiquitin ，在文章中是起到pull down的作用。

A: Ub-RhoG所接的Ub為monoubiquitin﹐且此實驗是使用dipeptide去切割，對於其他substrate切割的效率比較差，也切不太動，因此仔細看可以發現下方的線是很多不同顏色的線重疊在一起。

A:目前K63 的 tetra Ub在gel上對比其他會有較小的分子量，但為甚麼會有此現象還尚不清楚，也有可能是跑gel時，電壓不穩造成。

A: 不是模擬圖，這裡是指用X-ray 所觀察到的結構是一個USP54的S1 site 會和另一個 USP54的 S2 site 透過isopeptide bonds 相連，但其實實際上應該是一個USP54自己的S1 site 會和自己的S2 site結合(如4g所示)，所以作者才會做Fig 4f 的實驗證明。

A: 是細胞表面免疫球蛋白樣蛋白，會影響細胞間黏附，與上皮屏障有關。

A:對，只將USP53 knockdown並且未knockdown的對照組進行比較後，就可以知道缺少USP53所造成的影響（有些就不能被deubiquitin而留下ubiquitin chain）。

A:應該是不會一起，都是形成tricellular tight junction，這邊主要在講USP53、54 linkage type的發現，比較沒有著重在深入探討聽力障礙方面。

A: 作者為了研究和耳道問題以及膽汁淤積中USP-53所造成的影響，因此選擇用疾病發生的epithelial cell類型的CaCo-2 cell作為模型

Ａ：它是ubiquitin binding domain, 是pull down實驗中加入抓出ubiquitin的人工合成蛋白。

A：蛋白至少要連續接上四個Ub才會被degrate，接上一個是要告訴蛋白要做什麼。

Q: H&E、EM是看什麼的？

A: H&E 可以看發炎，圖上染細胞核是紫色，染細胞質與胞外基質是粉紅色，中間白色空洞是lipid，因此進行冷凍切片以ORO staining 更清楚可以看到lipid累積。

EM和Sirius Red是看細胞纖維化的情形。

A: 一種nucleophilic addition，發生在具有α,β-unsaturated carbonyl compound，像是4-HNE上 (一種α,β-不飽和醛類)。親核試劑 (像是-SH, -NH, -NH2)會去攻擊 β 碳，形成新的C–C或C–S / C–N鍵，產生共價adduct。

A:在本篇研究中看到ASKO小鼠，4-HNE會大量表現在核中，且先前研究發現SPTBBN1會被caspase 3切割成N-SPTBN1，進到核中，所以作者認為可能是N-SPTBN1將4-HNE帶入核中，但沒有相關的實驗證明。

Q:實驗中給予小鼠的西方飲食跟一般飲食有何差異?

A:在西方飲食中，為了模擬高熱量、高脂肪、高糖、高膽固醇的飲食模式，會提高飼料中脂肪、碳水化合物及膽固醇的相對比例，其中，脂肪約佔40-60%，碳水化合物約佔 30–40%，膽固醇約佔0.2–1%，比例會根據不同廠牌有所差異。

A: 使用Primary human hepatocytes、Kupffer cells、Stellate cells模擬真實肝臟結構，於MASH induction medium懸浮培養，誘導脂質累積。這種方法能更貼近於人體環境的病理及訊號傳導。

A:因為根據前面實驗發現小鼠在約 12 個月時才會出現明顯脂肪肝與纖維化的病灶，因此從約 10 個月開始連續 7 週注射 siRNA，使 SPTBN1 持續的被抑制，以觀察是否能改善已形成的病變，並且，siRNA 效果維持時間短，需要多次注射才能達到穩定 knockdown。

A: 這裡可以證明的是「誰」最會受到4-HNE的影響，可以說在同時knockout Sptbn1及Aldh2的狀況下還是有回升，代表4-HNE的主要目標是Sptbn1。

A: 因為他們發現小鼠死亡率太高了，不適合。

A：作者除了發現4-HNE的修飾會提高N-SPTBN1的產生外，在上一篇研究中也發現SPTBN1會利用cas3切割成N-SPTBN1，因此他們推測可能的機制是4-HNE會幫助cas3介導的SPTBN1切割，至於實際上是不是這樣他們並無利用實驗去做驗證。

A: 插入lox p site 後，利用liver specific的 albumin-cre去做編輯，且要經兩代交配後才會產生

A:是的，此篇文章是只針對公小鼠。

A:這部分沒有想過，會稍後回去查清楚

A: 該band應該是抗體非特異性結合的產物。

Q：

Fig2 WB結果看的protein都有什麼function？

A：

USP28需要FBXW7(E3 ubiquitin ligase 的一部分，負責辨識substrates)，辨識NICD(Notch Intracellular Domain)，而c-JUN,Cyclin E是NICD的target。

A: HEK293是人類胚胎腎細胞。transfection效率高，適合用來做PPI及分子機制相關的研究。

A:作者從外面拿到的不同的KO cell line，應該是代表編號。

A: 作者沒有提到，應該是沒有

Q:Fig 3A的NICD C-terminal不同長度的deletion，是有任何依據的嗎，例如某些片段具有特殊結構或功能?

A:作者沒有說明，可能沒有特別的依據。

A: 作者全部的11個都有分析，但這邊選出6個做為代表。

A:為了看清楚wt NICD的band所以還做long exposure

A: 是control, transfection時連空的vector都沒送入細胞。

A:綠點在臨床數據資料中是有顯著表現差異，但這CLL8 data中沒有顯著差異的基因。黑點是完全沒有顯著表現差異的基因。

A:Cycloheximide 是一種阻止細胞繼續產生新蛋白的 compound ，而在這篇 paper 是用來看關閉源頭後(新的蛋白質不再產生)，USP28 對NCID 的降解速度影響。

A:橫向虛線以上表示具有顯著差異;以下則無。而縱向虛線往右表示正相關;往左則是負相關。

A:#1和#2的sgRNA在method所示為兩種不同的sgRNA，但至於是如何製備的，要回去查詢。至於後續作者是使用哪一種sgRNA，作者並沒有特別表明。

A: 主要是從44位病人prostate cancer的samples去做IHC染色，可以主要看棕色的部分，當DTX3L表現高時，TIRR的表現會下降。因此在6b的圖中可以看到DTX3L和TIRR兩者的IHC score呈現負相關的結果。

Q：WT旁邊的EV是代表什麼？

A：Empty Vector（空載體），做為control

A:

Vinculin 出現於細胞質中，Lamin B1 出現於細胞核中，兩者用以確認純度，當對照。

γ-H2AX：於DNA損傷時會出現，用以確認DNA損傷

A: IR是輻射照射，cisplatin則是可以嵌在DNA中導致螺旋的不穩定，造成DNA DSB，CPT則是和isotopomerase結合，造成螺旋壓力過大，polymerase經過會卡住，造成SSB，接著造成DSB

A: 80-90%的辨認都是依靠XPO1，他們做成功就沒有做別的了

Q:圖4E中的++是什麼意思?

A:+代表有 transfect Myc-DTX3L，而++代表transfect 加量的 Myc-DTX3L。

A:雖然作者沒有特別說為什麼第二個點會上升，但總體來看如果跟TIRR-K187R結合後 是可以延長half-life 的。之後老師補充，做此種實驗不會只做一次，而是做多次後統計出來的結果，因此凸出來上升並不會影響結果，沒有顯著差異。

A:講者說要回去查資料補充。我認為可能的原因有TIRR的Ub是增加XPO1的binding能力，所以即使沒有Ub，XPO1也會與TIRR結合，另一個方向是可能不只有DTX3L 這個E3 ligase調控，可能由其他E3 ligase加上Ub，使XPO1能與TIRR結合。

A:U2OS細胞因為核形清晰、p53 pathway功能正常、易於基因操作且有成熟的DNA repair reporter系統，因此被廣泛用來研究DNA repair路徑。

A: 是一種標記

Q：DARPP-32跟MAP-2有什麼差異？

A：DARPP是專一看MSN，MAP-2是染神經細胞樹突的部分

Q:關於所選用的Q7 & Q111是人工使CAG repeats增加還是是野生的？

A:為人工knockin 促使CAG repeats的差異。

A: 兩者和MT-CO2皆作為粒線體能量生成的enzymes，但在這個結果中只有MT-CO2會受到NEDD4L的影響。

Q:圖4B為什麼要看粒線體的morphology，粒線體的型態跟他的功能有什麼關係?

A: 圖4B中可以看到縮小的粒線體，由於電子傳遞鏈的complex位於粒線體膜上，較小的粒線體，膜體積較小，帶有的complex減少，因此產出能量的能力下降。

A:使用imageJ 從神經細胞的cell body到axon terminal的平均長度。

A：因為所測的是OCR，所以ATP production 是指第一段去扣掉加入Oligomycin 的部分就是Fig 4J ATP production 的數值。

A:分別取上清液以及pellet跑膠就可以判斷是否為soluble

A: HO看的是細胞核的裂解，當細胞死亡，其細胞核會產生裂解。

細胞啟動凋亡機制時的通路為Caspase-9 → Caspase-3，因此檢測cas3可得知細胞是否啟動凋亡。

答：他是測環境中的氧氣量，然後藥是加在溶液中，但具體怎麼測可能回去要查一下

Ａ：由ＭＳＮ所組成，退化會導致ＨＤ

A：PGC1-a和TFAM作為輔助轉錄因子，會影響粒線體的電子傳遞鏈。

Q：在Figure3為什麼要使用HEK293 跟AD293 cells人類細胞來進行實驗？

A：因為海蛞蝓是較低階的動物，不確定他的蛋白質是否真的有功能，因此把P2X clone 到人類細胞，確認目標蛋白質有功能性。

A:在4D中是用lysochecker去染葉綠體降解後產出的酸性物質；在4E中是用電顯去看那些葉綠體結構被破壞後套色上去。

A: 葉綠體被分解時，除了產生油滴外，裡面像是葉綠素有關的蛋白也會被分解 (但不會被包在油滴內)，而這些蛋白的分解也能夠作為能量去回收給處於飢餓狀態下的海蛞蝓。

A: PA是電流大小，PF是細胞膜電流。電流可能因細胞大小而有誤差（大的細胞電流較大），因此需除以細胞膜電流平衡。

Q: Elysia crispate 如何在消化藻類時保留完整的chloroplast而不被digest掉?

A: 詳細機制還不是很了解，但推測可能是因為chloroplast上有一些特殊的marker，可以讓宿主辨認「這是我要的」而不被消化。

A:PSA屬於光系統I，PSB屬於光系統II，其中各個不同基因所處階段不同重要性也不同，因此對starvation效應的反映會有所不同

A: 去和資料庫進行比對

A:葉綠體被降解後雙層膜會成為小油滴，所以可進行BODIPY染色。

A:不確定，海蛞蝓的腸道細胞可能不像人類這麼複雜，目前知道的是腸道上皮細胞會endocytosis葉綠體。

A：Sea slugs 在攝取海藻的時候因為其口器大小和葉綠體一致，就會使其保存葉綠體。

A：結論的部分有口誤，是驗證了fig1.H圖中無飢餓的狀態。

Q：Fig3 I和 3 III中，為何site 2的螢光強度會變高？

A：因為3 III中有可能藉由site 1再轉移到site 2，而其中螢光的轉移並非單純地1：1轉移，有可能增加有可能上升，因此二者強度的差異沒有具體意義的關係。

Q:為什麼Fig4 i 會突然看了fatty acid?

A:因為他是FFA1是free fatty acid receptor，想看fatty acid ligand對site1 site2結合的影響

A: cy3.5和cy5其實都可以受到NBD的激發產生emission，因此作者使用這兩種不同的螢光基團是想看對於Ca2+的產生或是BRET的結果有什麼影響。

A: 因為圖C和圖Ｄ的control就是在看luciferase有沒有激發Cy5

A: 從Fig4 和Sup6.中可以看到 PPTQ 會和site1 競爭，雖然也會讓site2變化，但其實是只有和site1 競爭，而site2 是被影響到而產生變化。

A:

能同時測量不同化合物對受體的結合強度，篩選出 affinity 足夠高的藥物。

觀察兩個配體是否因受體allosteric effect而干擾彼此 binding。

了解兩個site互相影響，避免side effect，使藥物使用能有更好的選擇。

A: 450 nm是Nluc的emission波長，540 nm是NBD的emission波長，當Nluc的能量轉移給 NBD時540 nm會上升，比值表示有能量轉移訊號，tracer有結合

Q:若GPCR這種大型的protein在Nluc位置的附近有潛藏的binding site，那會不會擋到這個binding位點?

A:確實有可能擋到這個binding site，這也是此技術的限制之一，也因此作者盡量縮小了Nluc的大小。

A:不代表結合強度比較強。BRET高低主要反映 Nluc與螢光配體之間的距離與能量轉移效率，產生的emission強弱，不是結合親和力。

A：指的是這兩個construct有相近的binding affinity，且不會影響其對於FFA1的結合。

Ａ：fig 1B是以cpd 60為templet，或是因為化學結構、專利等因素導致無法進行後續修飾。

A：他是比較控制組上升的細胞再去區分細胞的種類得到各式各樣的群。

A:相對於對照飲食的代謝物百分比

A: 這裡的結果主要是想表達lung TICs細胞lipogenesis相關的基因表現量會比Adh細胞多。至於ACAT1和ACAT2的band粗細不同可能是因為各自抗體偵測的不同，或是分別用不同的membrane等實驗因素。

A: 圈圈代表碳，綠色填滿代表是有¹³C 標記的碳，來自β-hydroxybutyrate

A: 不是所有癌細胞都能使用酮體代謝，其他癌細胞則可能偏好 lactate metabolism、glycolysis、glutaminolysis 或 fatty acid oxidation (FAO) 等路徑以維持生長。

Q:用qRCR去測量的

A: 這張圖只是在看在low glucose的狀況下，加入acetoacetate會讓腫瘤生長較快而已

A:是個組別的小鼠都打入該組別細胞的細胞數為50000顆。

A: 是作者統計出來的結果，可以看到11、12、13都是和TICs有關係

Q:圖1J的粉紅色細胞群，分別分布在左上角和右下角，既然他們同屬同一種細胞，那為甚麼他們在統計圖中分布在不同的位置?

A:講者說明會回去再確認。

A：表示不同長度的脂肪酸。

Q: GUV assay是看什麼的？

A: GUV是巨大單層脂質體，是由人工製造的，用來研究protein interaction。

Q：Fig 6D中如何框選螢光檢測的範圍，以及是否有做normalize?

A：他們打的雷射範圍是固定的，所以他們框選的位置就是雷射打的位置；而作者並未言明這張圖是否normalize，呈現倍數關係 。

A: 在外圍一小塊的部分，因為ANXA2經過突變後會無法被calpain切割，形成的痂也相對比較緻密也稍微大一點的樣子。

A: 重型將C¹²和N¹⁴改成C¹³和N¹⁵

A：鈣離子因為帶2+，所以推測應該是會透過膜上的通道進入細胞，所以細胞膜無孔洞時，鈣離子還是可以進入細胞。

A: 看影片就可以看到整個過程，確認那些點點是從膜掉出來的vesicle

Q:在圖3A中，為什麼ANXA2會有兩條band?

A:由於ANXA2會被calpains(後面實驗發現)切割，因此出現兩條molecular weight不同的band。

A:在膜損傷時Annexin會最先到達損傷位置形成scab，而後calpain才會抵達損傷位置對annexin進行切割。

A1: FM1-43是不會穿模的染劑，只會染在細胞的最外層，所以橘色部分是細胞的輪廓，中間也有橘色是因為confocal顯微鏡的關係，可能從一個平面上看會和其他層有交疊，所以才會出現一點訊號

Q2: 為何實驗要交錯使用葡萄糖梯度和iodixanol梯度？

A2: 因為iodixanol對於EV比較不會刺激，可以更完正的保留vesicle，而且解析度也更高可以分得更細

A:是以雷射消融開始的時間點為T=0,負的秒數代表雷射消融前幾秒，之後的秒數就是雷射消融後的時間點。

A: 因為100k Pellet 中純淨的pellet，不會有核內多餘的protein。