Opera iconica ed enigmatica della pittura mondiale, si tratta sicuramente del ritratto più celebre della storia nonché di una delle opere d'arte più note in assoluto. Il sorriso quasi impercettibile del soggetto, col suo alone di mistero, ha ispirato tantissime pagine di critica, letteratura, opere di immaginazione.

Nel dicembre 2016 l'opera, insieme all'intera collezione Czartoryski, è stata ceduta al governo di Varsavia per circa 100 milioni di euro, creando non poche polemiche, poiché il valore complessivo sarebbe di 2 miliardi di euro.

Si tratta della più celebre rappresentazione dell'Ultima Cena, capolavoro di Leonardo e del Rinascimento italiano in generale.

L'opera raffigura le tre generazioni della Famiglia di Cristo: 
Sant'Anna, sua figlia Maria e Gesù bambino.

Anna tiene Maria sulle ginocchia, quasi fondendosi l'un l'altra; Maria sta per afferrare il Bambino sporgendosi verso destra, mentre egli gioca con un agnello, prefigurazione della sua futura Passione.

La composizione, ricca di significati allegorici, è modellata efficacemente secondo una forma piramidale, come in molte celebri pale rinascimentali, con la sommità nella testa di sant'Anna, che assume quindi un'importanza preminente. Essa lancia uno sguardo benevolo e sorridente a Maria e a Gesù, con una fisionomia tipica della produzione matura di Leonardo.
Il suo ruolo è quello di simboleggiare la Chiesa che, ostacolando l'azione di materna apprensione di Maria, ribadisce la necessità del sacrificio volontario di Gesù.

Ad accogliere la scena è un paesaggio roccioso, caratterizzato da fiori e piante acquatiche, descritti con minuzia da botanico. In lontananza si intravede un corso d'acqua. Al centro, Maria allunga la mano destra a proteggere il piccolo san Giovanni in preghiera, inginocchiato e rivolto a Gesù Bambino, che si trova più in basso, a destra, in atto di benedirlo e con il corpo in torsione.

Dietro c'è un angelo che accenna un leggero sorriso, coinvolgendo lo spettatore nella rappresentazione, e indicando con la mano destra il Battista. La mano sinistra di Maria si protende in avanti come a proteggere il figlio.