Tenho em mim todos os sonhos do mundo.

----Fernando Pessoa

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Olá!! Chamo-me Leonor Santos e tenho 17 anos. Frequento o 12º ano de escolaridade na Escola Secundária de Rio Tinto no curso de Ciências e Tecnologias, tendo escolhido as disciplinas de Inglês e Biologia.

Esta escolha em particular diz muito sobre mim. Sempre gostei da língua inglesa, escrevo pequenas histórias e muitos poemas. A escrita é a minha forma favorita de expressão e descobri que, quando o faço em inglês, consigo exprimir, mais detalhadamente, ideias e sentimentos. Outra área que me desperta grande interesse é a Biologia: desde que me lembro sempre tive um fascínio inexplicável por tudo o que era ciência, desde Astronomia e Física a Química e Biologia. Toda esta curiosidade e fome de informação é fruto de um hábito que tenho desde pequena de ler livros, ver séries e pesquisar notícias sobre os mais variados assuntos científicos. Vejo esta minha curiosidade como uma das minhas maiores qualidades, pois permite-me, mesmo que inconscientemente, saber sobre muitos assuntos e, acima de tudo, gostar do processo de aprendizagem.

Tenho uma enorme paixão por fotografia. Para mim, documentar o que se passa à minha volta e conseguir transpor, na forma de uma fotografia, o mundo do meu ponto de vista, é das melhores sensações que existe. Fotografar é uma maneira excelente de explorar uma cidade, a melhor forma de apreciar a beleza de uma pessoa e um meio de conexão com a comunidade de pessoas que também tem fotografia como interesse pessoal.

Sou grande apreciadora de filmes, isto porque sinto que me atingem de uma maneira profunda. Tenho uma enorme facilidade de me identificar com personagens e de criar empatia pelo seu passado, fico emocionalmente presa às histórias e isso faz com que as interprete de forma complexa e sentimental. Ouço quase todo o tipo de música sendo música clássica a minha favorita para ouvir enquanto estudo. Tenho um carinho especial pela dança e pelo desenho, embora já não os pratique tão frequentemente, e absolutamente adoro jogos de tabuleiro.

Sempre tive grandes sonhos, sempre senti que a minha vida seria destinada à perfeição. Com o passar do tempo aprendi a aceitar a imperfeição em tudo e que é nela que encontro o espaço e motivação para crescer. Até hoje convenço-me de que seria bem sucedida em qualquer carreira que escolhesse. Isso deixa-me bastante indecisa e com dificuldades no que toca a escolher o que um dia será a minha profissão. Já revirei todas as possibilidades e cheguei à conclusão que fotografia é o meu propósito. Porém, é algo que escolhi manter como passatempo e focar-me noutra área que, se tudo correr bem, me trará sucesso.

Este ano, tive a oportunidade de participar no desenvolvimento de projeto de investigação no Instituto de Investigação e Inovação em Saúde da Universidade do Porto e vou documentar todo o processo do projeto em publicações neste Padlet que partilho com a minha colega Naftali. Com isto, espero conseguir alcançar os meus objetivos no secundário e seguir os meus estudos em Biologia na Universidade do Porto.

Chamo-me Naftali Makiesse, hoje falarei um pouco de mim e terão a oportunidade de conhecer quem é a Naftali e de onde surgiu.

Nasci no dia 12 de fevereiro de 2005 em Angola (atualmente tenho 18 anos de(idade).

Desde a minha infância fui sempre mimosa, curiosa, e chorona (a menina da mama), estudei em várias escolas como:a frâncesa e portuguêsa.Desta forma,tive a vantagem de aprender essas duas línguas que, posteriormente,virão a ser-me úteis.

O meu desenho animado favorito era Barbie moda, tornando-me apaixonada pelos looks e de moda, portanto sempre quis ser estilista, ter a minha própria marca como a da Barbie. Quando fiz os meus 18 anos conversei com a minha mãe sobre a minha paixão e o que realmente amava de fazer.Surprendemente fiquei após a sua reção,esperava de uma resposta negativa por sua parte sobre a minha paixão. pelo contrário sugeriu-me o curso de enfermagem, que consiste em salvar vidas dos outros. Irei de aprender, não só a cura ou salvar vidas, mais também a empatia: a capacidade de colocar-se no lugar do outro. Porque de facto é o mais importante do que estar a inventar montes de estilos vestimentários.

Foi difícil aceitar a proposta vinda pela minha mãe,desde lá então duro anos e anos em consentir-me com a situação. E no final percebi a razão dela,foi além dos meus pensamentos que no fundo queria apenas o meu bem e da sociedade. Com certeza uma mãe, não procura os seus próprios benefícios, mas o melhor para os seus filhos.

Para isso, transferimos as amostras para falcons de 50 mL diluído em PBS (volume de PBS igual ao volume total da amostra).

O sangue foi então passado para tubos SEPMATE contendo 15 mL de Histopaque cada e foram centrifugados por 20 minutos a 1200G, sem travão.

O PBS possui muitas aplicações, pois não é tóxico em relação às células e é isotónico (a osmolaridade e as concentrações iónicas das soluções coincidem com as do corpo humano).

Pode também ser utilizado para diluir diferentes substâncias, ou como uma solução para limpeza celular.

É qualquer célula do sangue periférico com um núcleo redondo. Essas células consistem em linfócitos (células T, células B, células NK) e monócitos, enquanto os eritrócitos e plaquetas não têm núcleos, e os granulócitos (neutrófilos, basófilos e eosinófilos) têm núcleos multilobulados.

Nos humanos, os linfócitos compõem a maioria da população de PBMC, seguida por monócitos e apenas uma pequena percentagem de células dendríticas.

15 mL células + 30 mL PBS

Estas células foram centrifugadas (lavagem) por 15 minutos, 400 G, 8ºC.

O sobrenadante foi descartado e foi adicionado MACS buffer às células que ficaram depositadas no fundo do falcon.

Depois, no eppendorf "10" foram adicionados 10 µL de células, foi homogenizado e retirados 10 µL que seriam transferidos para o eppendorf "100". A mistura voltou a ser homogenizada e foram retirados 10 µL, transferidos para o eppendorf "1000". Só a partir deste é que são retirados os finais 10 µL que serão colocados na câmara de Neubauer para a contagem das células.

As MicroBeads CD14 são usadas para a seleção positiva ou deleção de monócitos humanos e macrófagos de sangue umbilical ou PBMCs. O antigénio CD14 pertence ao complexo recetor LPS. CD14 é fortemente expresso na maior parte dos monócitos e macrófagos e pouco presente em neutrófilos e algumas células dentríticas mieloides.

• Primeiramente, as células CD14⁺ foram magneticamente rotuladas com MicroBeads CD14. Para isto foi determinado o número de células, a suspensão de células foi centrifugada a 300 G por 10 minutos e ressuspendida em 80 µL de tampão MACS por 10⁷ células totais.

• A estas foram adicionados 20 µL de MicroBeads CD14 por 10⁷ células totais.

• Depois, foi equilibrada uma coluna com tampão MACS (coluna MIDI)- 0,5 mL tampão MACS à qual a suspensão de células foi adicionada.

• Foram feitas duas lavagens com 3 mL de tampão MACS. As células CD14⁺ rotuladas ficaram retidas na coluna enquanto as células não rotuladas passaram na lavagem.

• A coluna foi retirada do campo magnético e colocada num falcon. Foram pipetados 5 mL de tampão MACS para dentro da coluna e rapidamente empurrados, juntamente com as células magneticamente rotuladas, com o êmbolo.

Desta forma foi possível separar as células CD14⁺ das restantes.

Para a construção da placa foram colocados 100 µL de células + 100 µL de estímulos por poço, totalizando 200 µL por poço.

Os poços com células foram rodeados por poços com PBS para que não evaporar e perder volume.

Dia 25 tivemos a oportunidade de observar as células nos poços antes de uma nova substituição de meio (Fig.8). Para esta mudança de meio, as células foram expostas a combinações diferentes de LPS, parasita (NCT) e interferão gama (γ):

•células + meio

•células + meio + LPS

•células + meio + parasita

•células + meio + interferão γ (500 ng/mL)

•células + meio + interferão γ (100 ng/mL)

•células + meio + interferão γ (10 ng/mL)

•células + meio + parasita + interferão γ (500 ng/mL)

•células + meio + parasita + interferão γ (100 ng/mL)

•células + meio + parasita + interferão γ (10 ng/mL)

  Foram transferidos 80 µL de cada um dos poços para as placas novas de fundo redondo e adicionados 100 µL de Nyzol.

Cada célula ou partícula é analisada por dispersão de luz visível ou por fluorescência à medida que as células fluem rapidamente após cada laser.

Independente da análise de dispersão de luz, as medições de fluorescência são obtidas por transfeção e expressão de proteínas fluorescentes comuns e coloração com anticorpos fluorescentemente conjugados ou corantes fluorescentes.

O funcionamento deste equipamento consiste em excitar (com lasers) os fluorocromos ligados às células (ou moléculas) de interesse. A partir da difração da luz, torna-se possível adquirir dados tangíveis sobre a natureza do alvo de interesse.

Esta técnica foi utilizada ao fim do dia, com as células CD14⁺, CD14⁻ e com uma amostra total das células. Com ela foi possível analisar aspetos como quantidade de células por característica (neste caso, CD14⁺ ou CD14⁻) como forma de aprender a interpretar os resultados da citometria de fluxo, visto que a vamos utilizar novamente, mais à frente.

Meio gradiente de densidade - Facilitam a separação das células desejadas de uma mistura complexa (ex: amostras de sangue ou tecido inteiros), com base em características ou marcadores específicos. O método de centrifugação de gradiente de densidade separa populações de células específicas de partículas biológicas com base na faixa de densidade do meio gradiente e partículas de amostra.

Utilizámos teste ELISA para quantificar as citocinas IL-8 e TNF-α nas placas.

O vídeo anexado explica, de forma resumida, os tipos de teste ELISA e como funcionam.

Este anticorpo vai capturar o antigénio. As placas foram lavadas com PBS e Tween, um detergente que reduz as ligações hidrofóbicas entre as proteínas, aumentando a especificidade.

Os standards servem de referência quando for feita a espetrofotometria. Esta técnica baseia-se na medida quantitativa da absorção da luz pelas soluções, onde a concentração na solução da substância absorvente é proporcional à quantidade de luz absorvida.

Foram adicionados 100 µL por poço de amostras ou standards diluídos em PBS e as placas foram incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. Neste tempo, a citocina ligou-se ao anticorpo até todo ele estar ligado, saturando. Foram feitas mais 3 lavagens nas mesmas condições, descartando as citocinas livres.

• anti TNF-α + Buffer

• anti IL-8 + Buffer

Este segundo anticorpo que vai ser adicionado, que está associado a uma biotina, vai ligar-se a outro epítopo da citocina.

Foram adicionados 50 µL desta solução por poço e as placas foram incubadas por 30 minutos. Após a incubação, cada placa foi lavada 5 vezes.

O substrato vai dar início à atividade enzimática da HRP que está associada à Streptavidina e a peroxidase é metabolizada. Isto leva a que os poços adquiram uma cor azul, sendo a sua intensidade proporcional à quantidade de citocinas.

A reação foi então interrompida usando ácido sulfúrico (H₂SO₄) para termos a certeza que cada poço foi sujeito às mesmas condições e para que este mude de cor para um tom de amarelo.

N. caninum é também uma das principais causas de aborto em bovinos em muitos países sendo a principal via de transmissão a transplacentária.

O cDNA (DNA de cópia ou DNA complementar) é o DNA sintético que foi transcrito de um mRNA específico através de uma reação usando a enzima transcriptase reversa. Enquanto o DNA é composto de sequências de codificação e não-codificação, o cDNA contém apenas sequências codificantes.

Esta semana, tínhamos como objetivo extrair o RNA das células. Precisávamos de condições que permitissem que o RNA se mantivesse intacto, então, trabalhámos na hotte e com materiais livres de Ribonucleases (RNases). Isto porque, as RNases são um grande grupo de enzimas hidrolíticas que degradam as moléculas de ácido ribonucleico. Catalisam a quebra do RNA em componentes menores, operando nos níveis de transcrição e tradução.

Estas enzimas estão presentes na maioria das superfícies e é necessária a sua eliminação para este processo, para isso, utilizámos RNase AWAY, um agente de descontaminação de RNase, o que inibiu a atividade da enzima e preservou as cadeias de RNA.

O TRIzol é um reagente à base de ácido-guanidínio-fenol idealmente projetado para a extração de RNA. O sal de guanidínio serve para desnaturar proteínas e o fenol é um composto orgânico também utilizado para extrair ácidos nucleicos e proteínas.

Este link foi resultado de uma pequena pesquisa de preparação para esta sessão com o objetivo de entender melhor o porquê de alguns passos do protocolo de purificação de RNA usando TRIzol:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20516177/ - consultado a 28/02/2024

O conteúdo dos 25 diferentes poços da placa foi transferido para 25 eppendorfs numerados de 1 a 25, aos quais adicionámos 100 µL de TRIzol em cada um.

Adicionámos 80 µL de cromofórmio por eppendorf, tendo estes sido vortexados por 15 segundos, cada um. Posteriormente, foram deixados a incubar durante 15 minutos em gelo e, logo de seguida, centrifugados a 13000 rpm (rotações por minuto), durante 15 minutos e a 4ºC. Esta centrifugação permitiu-nos ter a certeza que o cromofórmio teve a possibilidade de atuar sobre todas as células, provocando a separação por fases e originando as diferentes camadas.

O RNA presente na fase aquosa superior tem que ser recolhido por precipitação à base de álcool. Para isso, a fase aquosa de cada eppendorf foi transferida para novos eppendorfs e foram adicionados 150 µL de isopropanol por eppendorf. O isopropanol vai promover a precipitação do RNA.

Para precipitar o RNA, os tubos foram incubados até à semana seguinte a -80ºC.

Após a centrifugação dos eppendorfs, o sobrenadante foi descartado com pipetas de filtro e foram adicionados 400 µL de Etanol 70% por eppendorf e vortexou-se.

Como o nosso pellet seria pequeno, centrifugamos os eppendorfs a 10000 rpm, durante 10 minutos e a 4ºC. Para secar o pellet, retirou-se a maior parte do etanol com uma pipeta e deixou-se secar ao ar por alguns minutos. Acabámos por ter que esperar por esta secagem mais que o normal por não termos retirado etanol suficiente logo numa primeira fase.

Em cada eppendorf numerado de 1 a 24 adicionámos:

• 12 µL desta solução;

• 2 µL de RNA;

• 8 µL de água.

No eppendorf "RNA" adicionámos :

• 2 µL de RNA do eppendorf 25;

• 20 µL de água.

Este eppendorf vai servir como controlo pois, no PCR, apenas será amplificado DNA genómico, uma vez que o RNA não será polimerizado em DNA pela transcriptase reversa. Este eppendorf vai comprovar que todo o DNA analisado terá origem em transcritos e não em DNA genómico. Desta forma, conseguimos comprovar a não contaminação das amostras por qualquer tipo de DNA genómico.

No eppendorf "H2O" adicionámos:

• 12 µL da solução preparada anteriormente;

• 10 µLde água.

Este eppendorf será utilizado como controlo. Isto porque, como não apresenta RNA, todo o DNA que possa ser encontrado nele terá origem na contaminação da água por algum DNA. Desta forma, podemos afirmar que a água utilizada não contém qualquer DNA ou RNA contaminante.

A máquina envia um feixe luminoso que irá atravessar a solução e incidirá num recetor. Consoante a concentração e composição das soluções certos comprimentos de onda não atingirão o sensor.

No nosso caso, visto que o RNA e a proteína absorvem comprimentos de onda diferentes, o feixe lido no recetor terá falhas em dois comprimentos de onda. Desta forma, poderemos determinar a presença de proteína nas amostras e a razão entre a concentração de proteína e a concentração de RNA. Nas nossas amostras pretendemos encontrar o máximo de RNA e o mínimo de proteína possível.

O protocolo de utilização do espectofotometro é bastante simples, apenas temos que o abrir e limpar a fonte de luz e o sensor, pipetar 2 µL da solução no sensor, fechar o aparelho e ler os resultados no ecrã.

Analisando a fig. 16, podemos notar o primeiro pico, que corresponde ao RNA, (mais especificamente aos compostos fenólicos a ele associado) e o segundo pico, correspondente à proteína presente na amostra.

Esta técnica utiliza variações bruscas de temperatura, juntamente com DNA polimerase. A DNA polimerase normalmente usada na PCR é chamada Taq polimerase, nome proveniente da bactéria tolerante ao calor da qual foi isolada (Thermus aquaticus).

Desaturação (96ºC)

• ‍  Aqueçer a reação para desnaturar os filamentos de DNA, separando a cadeia dupla em duas cadeias simples.

Recozimento (55-65ºC)

• Arrefecer a reação para que os primers possam ligar-se às suas sequências complementares no DNA do modelo de cadeia única.

Extensão (72ºC)

• Aumentar as temperaturas de reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novos filamentos de DNA.

Genes analisados:

• B2M (b-2-microglobulina) - responsável pela polimerização de glicoproteínas associadas ao MHC I;

• MARVEL d1 - responsável pela produção de proteínas associadas aos microtúbulos (filamentos de actina, também chamados de microfilamentos, e filamentos intermediários) que constituem o citoescleto das células;

• GBP4 (guanylate binding protein 4) - proteína associada à imunidade inata contra uma gama diversificada de patógenos bacterianos, virais e protozoários.

Sabendo que os dois primeiros genes apresentam uma expressão constante independentemente do estímulo a que são sujeitos, a quantidade de GBP4 foi comparada com as quantidades dos outros genes.

• 143 μL de Sybr Green Mix - contém bases e nutrientes necessários à polimerização e partículas que, quando integradas na cadeia dupla de DNA, emitem fluorescência. (quanto maior a quantidade de DNA maior será a fluorescência observada)
  
• 5,72 μL de Primer Forward - inicia a replicação de uma das cadeias de DNA
  
• 5,75 μL Primer Reverse - realiza a replicação da cadeia complementar
  
• 74,4 μL de água
  
  

• 5 μL de Mix Sybr Green
  
• 0.2 μL de Primer Forward
  
• 0.2 μL de Primer Reverse
  
• 2.6 μL de água
  
• 2 μL de cDNA
  

A informação correspondente à fluorescência emitida no início de cada um dos ciclos, será gravada (como já sabemos, quanto maior a fluorescência maior a quantidade de DNA).

No final do PCR será traçada uma melt curve pois a temperatura será aumentada até 95ºC. Com a elevação da temperatura, as cadeias de DNA vão desnaturar, libertando por isso menos radiação. Tendo em conta que, a temperatura de desnaturação varia entre os genes consoante a percentagem de pares GC e AT, ao fazer a melting curve, podemos confirmar que o gene que foi amplificado foi sempre o mesmo.

Ao cDNA, acrescentámos 8 μL de cada uma das soluções nos poços correspondentes, vedámos a placa e indicámos, num papel, o protocolo de PCR desejado.

Doenças das mitocôndrias (Fig.2):

https://www.tuasaude.com/doenca-mitocondrial/#google_vignette

(consultado a 16/03/2024)

Lebre-cantábrica (Fig.3):

https://animalia.bio/pt/broom-hare (consultado a 16/03/2024)

https://eol.org/pages/133005

(consultado a 16/03/2024)

Informações importantes à cerca do DNA mitocondrial (Fig.4):

https://www.infoescola.com/genetica/dna-mitocondrial/ (consultado a 16/03/2024)

https://images.app.goo.gl/jsTrwasipbPFXB1g7 (consultado a 16/03/2024)

Curiosidade a Doença de Leigh (Fig.5):

https://www.casahunter.org.br/doencas-raras/sindrome-leigh.php (consultado a 16/03/2024)

https://images.app.goo.gl/JcHdShkwG8ggnrv8A (consultado a 16/03/2024)

Efeito da temperatura em relação as alteraões climaticas nas mitocôndrias (Fig.6):

cplp.sef.https://ccnh.ufabc.edu.br/arquivos/CENTRAL/4.Ensino/1.Graduacao/TCCs/Marcela_Simoes_Teruel_versao_final_BacBio-QS.2021.1.pdf

(consultado a 16/03/2024)

Hereditariedade do DNA mitocondrial em relação com as alterações climaticas (Fig.6): ttps://www.igenomix.com.br/blog/mitocondrias-e-doencas-de-heranca-mitocondrial/

(consultado a 16/03/2024)

Informações úteis sobre as alterações climaticas (Fig.6): https://www.igenomix.com.br/blog/mitocondrias-e-doencas-de-heranca-mitocondrial/

(consultado a 16/03/2024)

Podem incluir mutações genéticas que afetam as proteínas mitocondriais, danos causados por radicais livres (stresse oxidativo), bem como exposições a certas drogas e toxinas. Além disso, doenças crónicas como: diabetes e obesidade têm sido associadas a alterações na função mitocondrial.

Alterações que envolvem herança de DNA mitocondrial podem causar problemas de crescimento, desenvolvimento e funções dos sistemas do corpo.

Ao fim da sessão cada aluno apresentou-se pelo seu nome e sua turma. Em suma foi um dia especificamente para esclarecimento do funcionamento do projeto e partilhas de identificações dos investigadores e de cada aluno.

Houve partilhas de espécie, onde cada aluno tevi o direito de estudar uma, pois devemos distinguir-nos, com intuito de obter resultados diferentes. 

Por exemplo: a min foi-me dado a espécie " Lepus castroviejoi", que abordei no início do projeto.

Os poços H2O e RNA não apresentaram crescimento, comprovando a não contaminação das amostras.

Conseguimos apenas uma as réplicas de cada um dos estímulos, exceto LPS e parasita + interferão (100 pg/mL).

Os poços H2O e RNA voltaram a não apresentar crescimento, comprovando a não contaminação das amostras.

Voltámos a conseguir apenas uma as réplicas de cada um dos estímulos, exceto LPS e parasita + interferão (100 pg/mL).

Não foi verificado crescimento no poço H2O, mas o poço RNA apresentou um ligeiro aumento (curva azul mais grossa), indicando a presença de DNA genómico, ou seja, estava contaminado.

No gráfico da Fig. 26 podemos observar que a fluorescência de todas as funções diminui no mesmo ponto, exceto a função azul (RNA) e a função laranja (parasita). Isto pode indicar que, no poço contendo parasita não ocorreu amplificação do gene GBP4, mas ocorreu amplificação de DNA genómico.

Agora em diante, apresentarei um novo projeto com objectivo de conhcer melhor como são e funcionam as " Bactérias ".

O que são Bactérias ?

As bactérias são seres procariontes, ou seja, não possuem núcleo definido, e seu material genético está concentrado em uma região que não é envolta por membrana. Essa região é denominada  nucleoide. Além do material genético presente no nucleoide, nas bactérias podem ser observadas moléculas circulares de DNA pequenas — chamadas de plasmídeos —, as quais se replicam independentemente. https://brasilescola.uol.com.br/biologia/bacterias.htm

1- Qual é a importância de se identificar bactérias:

A detecção e identificação de micro-organismos em qualquer ambiente é essencial para controle de qualidade, controle de processos de fabricação e manipulação, garantia da segurança em alimentos e qualidade microbiológica em ambientes hospitalares.

https://blog.neoprospecta.com/como-fazer-identificacao-de-micro-organismos/

2-Como se classificam-as : Monera, procarionte:

O reino Monera engloba todos os organismos procariontes existentes, compreendendo as bactérias, cianobactérias (algas azuis) e arqueias (procariontes primitivos). Atualmente o termo monera encontra-se em desuso, e seus integrantes foram divididos em outra forma de agrupamento, formando o sistema de domínios.

https://querobolsa.com.br/enem/biologia/reino-monera

3- Tipos de bactérias e as mais resistentes

"Classificação das bactérias

As bactérias são classificadas de diferentes formas, sendo uma delas o formato de suas células.

Observe os principais formatos apresentados pelas bactérias.

Cocos: bactérias que apresentam formato esférico. Podem ocorrer isoladas ou em agrupamentos. Quando ocorrem aos pares, são denominadas diplococos; quando formam uma cadeia, são denominadas estreptococos; quando se agrupam como um cacho de uva, são chamadas de estafilococos.

Bacilos: bactérias que apresentam formato de bastão. Podem ocorrer isoladamente, aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos).

Espirilos: bactérias com formato helicoidal e rígidas.

Espiroquetas: bactérias com formato helicoidal e flexíveis.

Vibrião: bactérias que apresentam formato de vírgula.

https://brasilescola.uol.com.br/biologia/bacterias.htm

4-"Bactérias gram-positivas e gram-negativas

Uma técnica denominada coloração de Gram permite classificar as bactérias em dois grupos, por meio da análise das diferenças existentes na composição da parede celular. Quando submetida à coloração de Gram, a parede celular das bactérias pode adquirir coloração roxa ou vermelha. As bactérias coradas de violeta são chamadas de gram-positivas e se caracterizam por apresentar uma parede celular mais simples e rica em peptideoglicano. As bactérias gram-negativas, por sua vez,  coram-se em vermelho e apresentam uma estrutura mais complexa, com menos peptideoglicano.

Determinar se uma bactéria é gram-positiva ou gram-negativa é importante para indicar, por exemplo, que tratamento deve ser adotado em caso de infecções. As bactérias gram-negativas, por exemplo, são, em geral, mais resistentes aos antibióticos que as gram-positivas.

5- "Importância das bactérias.

As bactérias, diferentemente do que muitos pensam, não são responsáveis apenas por causar prejuízos aos seres humanos, havendo muitas espécies importantes para a nossa saúde. No nosso intestino, por exemplo, há várias espécies de bactérias, as quais são fundamentais para garantir o funcionamento normal do órgão. A nossa microbiota intestinal auxilia na absorção de nutrientes, produz vitaminas e auxilia a evitar a proliferação de agentes patogênicos.

Nosso intestino é repleto de bactérias benéficas, que auxiliam no funcionamento adequado do órgão.

Economicamente, as bactérias são importantes, por exemplo, por serem usadas na fabricação de vinagre e iogurte. Não podemos nos esquecer também da toxina botulínica, produzida pela espécie Clostridium botulinum. Essa toxina é bastante utilizada para amenizar rugas e linhas de expressão. Alguns antibióticos também são produzidos por bactérias.

As bactérias também apresentam importância ecológica, atuando, por exemplo, na decomposição da matéria orgânica, junto com os fungos. As bactérias também participam do ciclo do nitrogênio."

https://brasilescola.uol.com.br/biologia/bacterias.htm

6-O QUE SÃO SUPERBACTÉRIAS E COMO ELAS RESISTEM AOS ANTIBIÓTICOS?

As superbactérias são cepas de bactérias que se tornaram resistentes aos antibióticos conhecidos, muitas vezes incluindo os mais modernos. As bactérias, como qualquer outro organismo, tentam sobreviver diante das tensões externas e têm a vantagem adicional de terem uma grande facilidade para sofrer mutações, assim como para se reproduzir; em condições adequadas, centenas de milhões podem aparecer em poucas horas. Isso permite que suas mutações de DNA sejam relativamente rápidas e, se estas modificações se mostrarem úteis e sobreviverem, essa mutação pode ser ainda mais refinada.

Porque que elas aparecem?

• viver ou trabalhar em condições sujas

• uso indevido de antibióticos

• Manuseio incorreto de alimentos

• práticas inadequadas de prevenção e controle de infecções

As superbactérias são cepas de bactérias, vírus, parasitas e fungos que são resistentes à maioria dos antibióticos e outros medicamentos normalmente usados para tratar infecções que elas causam.

https://www.iberdrola.com/inovacao/superbacterias

A técnica de coloração de Gram, desenvolvida pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram em 1884, é um método amplamente reconhecido para diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular.05/10/2023

https://pt.linkedin.com/pulse/colora%C3%A7%C3%A3o-de-gram-princ%C3%ADpios-e-procedimentos-fermentec-1f

8-Objetivo da técnica de coloração de Gram

Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram- positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.

https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf

9- Qual é a diferença entre Gram-posistivo e Gram- negativo

As bactérias Gram-positivas são classificadas pela cor que adquirem após aplicação de um processo químico denominado coloração de Gram. As bactérias Gram-positivas adquirem coloração azul quando essa coloração é aplicada a elas. (Outras bactérias se coram de vermelho. Elas são chamadas de Gram‑negativas.)

https://www.msdmanuals.com/pt-br/casa/infec%C3%A7%C3%B5es/infec%C3%A7%C3%B5es-bacterianas-bact%C3%A9rias-gram-positivas/considera%C3%A7%C3%B5es-gerais-sobre-bact%C3%A9rias-gram-positivas

10- Doençcas causadas pelo Gram positivo

Essas bactérias Gram-positivas, em forma de esferas (cocos) causam muitos distúrbios, incluindo faringite estreptocócica, pneumonia e infecções em feridas, na pele, em válvulas cardíacas e na corrente sanguínea.

https://www.msdmanuals.com/pt-pt/casa/infec%C3%A7%C3%B5es/infec%C3%A7%C3%B5es-bacterianas-bact%C3%A9rias-gram-positivas/infec%C3%A7%C3%B5es-estreptoc%C3%B3cicas

Os bacilos Gram-positivos causam alguns tipos de infecção, incluindo:

• Carbúnculo.

• Difteria.

• Erisipeloide.

• Listeriose.

11- Doenças causada pelo Gram-negativo

As bactérias Gram-negativas causam peste, cólera e febre tifoide. Essas infecções são raras em Portugal, mas são mais comuns em regiões do mundo com condições sanitárias precárias e/ou água e suprimento de alimentos inseguros.

https://www.msdmanuals.com/pt-pt/profissional/doen%C3%A7as-infecciosas/bacilos-gram-negativos/introdu%C3%A7%C3%A3o-a-bacilos-gram-negativos

12- Qual é o nome da bactéria utilizada em " Iorgurte"

O iogurte é produzido a partir da ação de uma cultura mista dos microorganismos Lactobacillus bulgaricus e do Streptococcus thermophilus.

Essas bactérias se mantêm em crescimento associado ou culturas separadas que são inoculadas no leite em proporções definidas. Geralmente, utiliza-se a proporção de 1:1 (cocos para bacilos), que definem as características reológicas e aromáticas ideais. As bactérias lácticas, em convívio simbiótico, estimulam-se mutuamente, complementando o crescimento uma da outra

https://www.einstein.br/noticias/noticia/iogurte

Desta vez utilizámos uma quantidade maior de DNA, neste caso 3 µL.

Para além disso, decidimos testar novos genes nos eppendorfs onde o teste PCR correu bem e forneceu os melhores resultados.

• 27,5 µL Sybr Green Master Mix;

• 1,1 µL de primer forward e primer reverse (correspondente a cada um dos genes);

• 8,8 µL de água.

Pipetámos 7 µL da solução para cada um dos poços e 3 µL de DNA dos eppendorfs 4,5,6,16,17.

Preparar as soluções para testar os genes TNF-a (gene responsável pela tradução da citocina TNF-a), iNOS (Sintase do óxido nítrico induzida - enzima que produzem óxido nítrico a partir da L-arginina. O óxido nítrico é extremamente tóxico para os parasitas, promovendo assim a sua morte), e GBP5 (guanylate binding protein 5 - proteína relacionada com a resposa imunitária das células e com a produção de citocinas).

Pipetámos também, para 3 eppendorfs, 60,5 µL de Sybr Green Master Mix, 2,42 µL de primer forward e reverse, correspondente a cada um dos genes e 31,46 microlitos de água.

Foram adicionados 8 µL da solução em cada um dos poços.

Adicionámos 3 µL de DNA dos eppendorfs para os poços correspondentes e de seguida vedamos a placa e escrevemos num papel o protocolo de PCR desejado. As placas foram deixadas no frigoríficos da sala PCR e o protocolo descrito e seguido foi o mesmo da semana anterior.

Planeou-se sobre a "Importância das Bactérias no dia-dia", os seus benefícios e os prejuízos,que podem causar no meio ambiente e no organismo de um ser vivo. Sendo assim, darei a iniciativa e a contextualização do projeto em sim. como todos nós sabemos que as "Bactérias" são células biológicas encontradas no meio ambiente, e no organismo de um ser vivos, em que são benéficas e patogénicas.

O objetivo crucial deste projeto foi de, identifcar bactérias e aprender sobre o procedimento denominada "coloração de Gram", que é baseada em descobrir bactérias de Gram-positivo e Gram-negativo.

A técnica denominada coloração de Gram permite classificar as bactérias em dois grupos, por meio da análise das diferenças existentes na composição da parede celular.

Quando submetida à coloração de Gram, a parede celular das bactérias pode adquirir coloração roxa ou vermelha.

As bactérias coradas de roxa são chamadas de gram-positivas e se caracterizam por apresentar uma parede celular mais simples e rica em peptideoglicano.

As bactérias gram-negativas, por sua vez,  coram-se em vermelho e apresentam uma estrutura mais complexa, com menos peptideoglicano.

Determinar se uma bactéria é gram-positiva ou gram-negativa é importante para indicar, por exemplo, que tratamento deve ser adotado em caso de infecções. As bactérias gram-negativas, por exemplo, são, em geral, mais resistentes aos antibióticos que as gram-positivas.

Linck: https://brqualityconsultoria.com.br/cuidados-importantes-com-meios-de-cultura-em-seu-laboratorio-de-microbiologia/

As bactérias aprofundadas são:

1-" Esherichia coli", encontrada no intestino humano , pertencem no grupo do Gram negativo.

2- " lactobacillus bulgaricus", encontradas no iorgurte, pertencem no grupo do Gram positivo

3- " "Lactobacilos", encontradas nas maçãs orgânicas, que beneficiam o organismo dos seres vivos e não causam doenças.

     "Procedimento de prevenção"

- Desinfetar o local antes da utilização
- Pôr lâmpada para esterilizar
- Usar: bata, luva e mascara 
- E por fim desinfetar o local após a utilização

         "Técnica" 
- Meio de cultura de placas com bactérias mais água destilada com ajuda da Ansa, colocamos nos tubinhos e misturamos até homogenização, durante este todo passo não devemos esquecer da lâmpada em volta de nos em que a cada momento usamos para desinfetar a ansa.

- Duas placas para cada tipo de bactéria em total foram 6 placas de bactérias

- Após da homogenização das bactérias e da água destilada, entramos no processo de colocação da mistura homogenicas nas placas utilisando dois elementos fundamentais para este processo: 

- Parafilme, ansa, lâmpadas desinfetante

1- parafilme:serve para prender a placae evitar a evaporação ou a penetração de bactérias desconhecidas que por consequência alterar os resultados esperados.

2- Ansa: serve para colocar a mistura homogenica na placa, sem esquecer de desinfetar a cada momento.


 3- lâmpada desinfetante: servi para esterilizar a ansa e desinfetar o local onde está sendo feita o procedimento.

Procedimento da técnica de plaquamento

• Homogenizar a solução de bactérias com água destilado, se for preciso

• utilizar a " Ansa" para a recolhar das mesma, sem esquecer da " lâmpada desinfetante, pois permite que a solução ão ser invadida por agentes desnecessário.

  
  

• Colocar na placa petri a mistura homogenizada, feito isso, esperar alguns dias enquanto estiver dentro da estufa. Após o tempo de espera, concede acesso para a próxima técnica denominada "Coloração de Gram"

  
  

  Este projeto teve como finalidade de: identificar bactérias e aprender a técnica de" Coloração de Gram ", pois durante o dia a dia, temos como agente acompanhante as " Bácterias ", que são benéficas e patogenicas para os seres vivos e ao meio ambiente.

Com isso iniciamos o processo chamado de" coloração de Gram". Que consiste em distiguir as "Bactérias"de Gram-positivo e Gram-negativo

• Lâmpada desinfetante: Como o próprio nome diz, desinfetar o local onde está ser feita a técnica

a) Cobrir o esfregaço com o corante violeta de genciana (corante primário) e deixar o corante agir por um minuto;

b) Escorrer o corante e lavar rapidamente a lâmina com água destilada;

c) Cobrir o esfregaço com solução de Iodo (mordente) e deixar agir por um minuto;

d) Escorrer o mordente e lavar rapidamente a lâmina com água destilada;

e) Inclinar a lâmina e gotejar a solução de álcool-acetona (descorante) por aproximadamente 15 segundos, até perceber que não está mais havendo descoloração;

f) Em seguida, lavar a lâmina em água destilada;

g) Cobrir o esfregaço com fucsina ou safranina (contracorante) e deixar agir por 30 segundos;

h) Escorrer o corante e lavar a lâmina em água destilada;

i) Ápos a técnica, levar ao microscópio onde será observado os resultados

Linck: https://www.ufrgs.br/aulaspraticasdemip/?page_id=134

• A cor vermelha: são bactérias de Gram negativas e causam doenças.

• A cor roxa: são bactérias de Gram positivas, beneficiam o organismo, por sua vez não causam doença.

Esta técnica procedeu com a ajuda da "Ansa", "Água destilada" esfregar superficialmente e profundamente, com intuito de homogenizar a água destilada e as bactérias, contida na maçã. Em que depois foram úteis, na técnica de plaqueamento, que ao longo do proejto irei de abordar.

Link: https://youtu.be/UhRvu8d4Y04?si=K3i2dPLf--QQ8T5I

Linck: https://www.splabor.com.br/blog/destilador-2/o-que-e-agua-destilada-conhecendo-os-beneficios/

Inicialmente trabalhámos no Excel que, apesar de apresentar certas limitações já que certas funcionalidades apenas estão disponíveis na versão paga, foi bastante útil na parte inicial da nossa organização de dados.

Nele introduzimos todos os nossos dados obtidos pelo ELISA Reader, na quarta semana, numa tabela. Estes dados consistiam na leitura de dois comprimentos de onda diferentes (450 nm e 570 nm). Uma das tabelas tinha como valor da absorvância 570 nm (comprimento de onda que corresponde às interferências que possam existir na placa utilizada no ELISA Reader), já a outra tabela tem o valor da absorvância a 450 nm (comprimento de onda que correspondente a amarelo).

De seguida, criámos uma tabela correspondente à subtração dos valores da tabela de 570 nm à de 450 nm (450-570). Isto minimiza a influência de interferências, contribuindo para uma maior precisão dos resultados.

Os dados correspondentes ao grupo de controlo foram assinalados e criámos duas tabelas, uma para cada conjunto de dados, cada uma correspondente a uma das placas colocadas no ELISA Reader.

Estes dados inseridos em cada tabela possibilitaram a construção de dois gráficos da absorvância em função das citocinas. Para isto os eixos x e y foram colocados em logaritmo o que facilita a interpretação dos dados dos gráficos. Após comparação dos dois gráficos, foi selecionado aquele apresentava menos desvios.

Uma vez com os valores de absorvância, determinámos a equação do gráfico e definimos uma equação que corresponde ao seu inverso. Assim, poderemos determinar a concentração de citocinas em função da absorvância.

Nele introduzimos todos os nossos dados obtidos pelo ELISA Reader, na quarta semana, numa tabela. Estes dados consistiam na leitura de dois comprimentos de onda diferentes (450 nm e 570 nm) - Tabelas A.

Uma das tabelas tinha como valor da absorvância 570 nm (comprimento de onda que corresponde às interferências que possam existir na placa utilizada no ELISA Reader), já a outra tabela tem o valor da absorvância a 450 nm (comprimento de onda que correspondente a amarelo).

De seguida, criámos tabelas correspondentes à subtração dos valores da tabela de 570 nm à de 450 nm (450-570) para cada uma das citocinas (TNF-α e IL-8) - Tabelas B. Isto minimiza a influência de interferências, contribuindo para uma maior precisão dos resultados.

Os dados correspondentes ao grupo de controlo foram assinalados e criámos duas tabelas, uma para cada conjunto de dados, cada uma correspondente a uma das placas colocadas no ELISA Reader.

Estes dados inseridos em cada tabela possibilitaram a construção de dois gráficos da absorvância em função das citocinas. Para isto os eixos x e y foram colocados em logaritmo o que facilita a interpretação dos dados dos gráficos. Após comparação dos dois gráficos, foi selecionado aquele apresentava menos desvios.

Uma vez obtidos os valores de absorvância, determinámos a equação do gráfico e definimos uma equação que corresponde ao seu inverso. Assim, poderemos determinar a concentração de citocinas em função da absorvância.

De seguida, criámos uma tabela como os valores de concentração obtidos através da equação e, seguindo o esquema que tínhamos feito na quarta semana, associámos cada valor de concentração ao respetivo estímulo. Como os valores dos dois animais apresentavam grandes diferenças entre si (cada uma das placas correspondia ao sangue de um animal diferente) optamos por fazer duas tabelas distintas para cada um deles.

Com esta aplicação fizemos as médias dos valores selecionados, organizando os valores em tabelas que nos permitem ver o desvio padrão. Nestas tabelas, também é necessário colocar a escala y em logaritmo.

Inicialmente, transferimos para a plataforma os dados das duas tabelas construídas anteriormente no Excel. Com eles, fizemos as médias dos valores e organizamos os valores em tabelas que nos permitiram ver o desvio padrão. Nestas tabelas também colocamos a escala y em logaritmo para uma leitura mais fácil dos resultados.

Dado isto, aplicámos o protocolo ANOVA que comparou os valores obtidos e nos indicou quais dos estímulos tiveram a maior diferença de valores.

Legenda das cores:

Grupos de controlo: amarelo

Poço vazio: cinzento

Legenda das cores:

Grupos de controlo: amarelo

Poço vazio: cinzento

Absorvância: colunas 2 e 5;

Concentração de citocinas: colunas 1 e 4.

Absorvância: colunas 2 e 5;

Concentração de citocinas: colunas 1 e 4.

Com a ajuda da nossa mentora, a análise dos gráficos das concentrações de citocinas IL-8 e TNF-α foi bastante simples de entender. Também aprendemos a otimizar a disposição e organização da informação no gráfico para uma leitura mais fácil.

Os valores de IL-8 são mais elevado nos poços com Neospora Caninum do que nos poços com interferão-γ. Conclui-se que o interferão não levou à formação destas citocinas, tendo sido o protozoário Neospora Caninum a incentivar a produção de IL-8.

Estes valores foram comparados com os valores do gene de referência, o que permitia definir se aquela quantidade de DNA foi atingida mais rapidamente ou mais lentamente do que no gene de referência.

Para concluir, estes dados foram transferidos para o GraphPad e foram organizados num gráfico.

A cor de rosa é possível ver os macrófagos e a verde os compartimentos ácidos que contêm o protozoário.

A mentora indicou-nos que no abstract devíamos descrever brevemente em que consistiu a experiência desde a introdução ao problema que visamos resolver, o objetivo final do nosso projeto e os resultados do mesmo bem como as conclusões que podemos tirar deles. E que, para além disto, devíamos incluir uma breve explicação do que é o interferão-γ.

A meio da sessão, fui com a nossa mentora ao laboratório buscar pósteres antigos de outros projetos que tinham sido desenvolvidos no I3S para nos servirem como exemplo tanto para a organização da informação, como tipo de linguagem e estrutura geral do póster.

Para otimizar o espaço que tínhamos no póster, resumimos a quantidade de texto em cada secção para reduzir o espaço que este ocupava e para futuramente termos margem entre os blocos de texto tanto para sentido estético como para podermos alterar a estrutura caso necessário, o que aconteceu na semana seguinte. Também anotámos todos os sites consultados para serem incluídos no código QR que foi adicionado mais tarde.