A1 Lab W5: Forensische DNA analyse deel 2: PCR op STRs optimaliseren by P3 Labvaardigheden (Padlet Account) https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w Periode 3 vaardigheden en-us 2023-02-06 14:04:03 UTC 2025-03-18 06:15:58 UTC hello@padlet.com https://padlet.net/icons/png/1f9ec.png 8 Keuze monsters en controles InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108302 Bij elk experiment zijn controles nodig om te weten of de data van het analysemonster betrouwbaar is. Beschrijf hier welke controles je wilt maken.
In de tabel staat een voorbeeld voor PentaE al volledig ingevuld en zijn sommige monsters deels ingevuld

Beschrijf per controle:
  • wat je controleert 
  • wat er wel of niet in het monster moet (welk DNA of welke primerset)
  • hoe de uitkomst er uit ziet wanneer het experiment goed verloopt

Controle   Primers   DNA   Nut controle   Verwacht resultaat
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...
...               ...             ...        ....                     ...


]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108302 4 Principe InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108305 Wat is het principe? Waarom werkt deze techniek?

Principes hoeven niet in je labjournaal, maar het is belangrijke kennis over technieken. Op de praktijktoets wordt naar principes gevraagd. De principes van dit experiment zijn ook belangrijk voor het project...

Als je in week 3 het principe van PCR zelf al besproken hebt hoeft dat nu niet meer. Je kan deze week focussen op het principe van multiplex PCR en DNA fingerprinting / STRs.

]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108305 5 Voorschriften InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108306 Noteer hier de benodigde voorschriften

In de opdracht tekst wordt vaak gehint naar de voorschriften. Kijk naar de opdrachttekst en kijk naar de index van de voorschriften. Als je dezelfde woorden tegenkomt zijn dat vast de benodigde voorschriften

  • ...
  • ...
]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108306 2 Doel InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108307 Wat is het doel van het experiment?

Voor het doel staan vaak hints in de opdracht tekst

...]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108307 3 Verwachting InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108308 Noteer hier de onderbouwde verwachting van het experiment

Tips:
  • Onderbouw je verwachting met informatie over de primersets die je op internet vindt (deze info heb je ook nodig voor project)
    • In het document DNA ladders primers en sequenties op moodle staan de precieze sequenties van de gebruikte primers, hiermee kan je kijken of je info over de correcte primerset hebt opgezocht
    • Deze primersets worden wereldwijd algemeen gebruikt voor forensische STR analyses, er is veel info over te vinden, er is bijvoorbeeld een STR database.
    • De primers die wij gebruiken horen bij de promega powerplex set
    • BLAST is niet handig voor de verwachting omdat STR DNA juist heel variabel is
    • Van elke primerset is bekend van hoe groot tot hoe groot de PCRproducten zijn die er gemaakt kunnen worden, zoek dit op (waarom is er voor STR analyse niet 1 grootte die je per primerset verwacht?) en vermeld per primerset de range waarin de PCRproducten horen te vallen als verwachting
    • Maak hier een tabel van, bijvoorbeeld zoals in de afbeelding 

Primerset      Resultaat:      Minimale Aantal bp          Maximale aantal bp
...
...
...
]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108308 12 Pipetteerschema mastermix multiplex InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108309 Noteer hier het pipetteerschema voor de mastermix met alle gebruikte primers. 

In dit pipetteerschema worden meer primers toegevoegd, er gaat dus minder demiwater in. In het voorbeeldschema is gerekend op 6 primersets. Wanneer je minder primersets gebruikt moet er per primerset 2 ul meer demiwater in. (Het volume niet-gebruikte primers wordt vervangen door demiwater)

Inhoud                     1 reactie (ul)         ___ reacties (ul)
template DNA
demiwater
PCR buffer
BSA
dNTPs
primer F
primer R
primer F
primer R
primer F
primer R
primer F
primer R
primer F
primer R
primer F
primer R
taq polymerase]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108309 6 Materialen InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108310 Noteer hier een tabel met de benodigde materialen

Zoek in de voorschriften en de opdracht op welke materialen nodig zijn, maak een tabel waarin je op het lab ook de fabrikant kan noteren. Geef aan welke materialen koud gehouden moeten worden

Materiaal, concentratie, opslaginstructie, fabrikant
...     ...     ...
...     ...     ...
...     ...     ...]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108310 16 Inzetschema gel InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108311 Noteer hier het inzetschema voor de agarosegel

Het is vaak handig om van tevoren te plannen hoe je de agarosegel gaat indelen. Welk monster gaat in welk slotje? Noteer dat hier.

1: 
2: 
3: 
4: 
5: 
6: 
7: 
8: 
9: 
10: 
11: 
12: 
13: 
14: 
15: ]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108311 1 Opdracht InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108312 Forensische DNA analyse deel 2: PCR op STRs optimaliseren

Deze periode bestaat het project uit CSI. Hiervoor moet je DNAsporen analyseren van een plaats delict. Tijdens het practicum ga je bepalen of het mogelijk is om DNA analyse efficiënter te maken door te testen of verschillende primers tegelijk gebruikt kunnen worden: de PCR multiplex maken.

De crime scene op de naaldwijkstraat bevat veel DNA sporen. Door van deze sporen een DNA profiel (DNA fingerprint) te maken kan onderzocht worden welk spoor van welk persoon afkomstig is. Dit kost veel tijd wanneer er veel STRs en veel monsters geanalyseerd moeten worden. Om het efficiënter te maken krijg je de opdracht om te bepalen of dit met een multiplex PCR reactie kan. In zo'n PCR worden meerdere primersets tegelijk gebruikt. Primers voor 5 verschillende STRs en amelogenine zijn aanwezig.

Bepaal voor minmaal 3 en maximaal 6 primersets of de primers een PCR product kunnen opleveren en bepaal of ze tegelijk in 1 reactie gebruikt kunnen worden.

Aanwezig materiaal:
  • Standaard reagentia PCR
  • Primers Th01, PentaE, D18S51, amelogenine, D21S11 en D3S1358
  • Humaan DNA male en humaan DNA female
  • Je eigen geïsoleerde DNA

Experimentopzet:
  • Kies een DNA (male of female) om elke primerset mee te testen
    • (test met dat DNA ook de PCR met al jouw primers samen in 1 reactie (multiplex) werkt)
  • Kies je eigen DNA om te zien of je inderdaad een ander profiel krijgt dan bij het testmonster
    • Als je niet je eigen DNA wil gebruiken kan je het andere human DNA gebruiken voor dit monster

]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108312 7 Veiligheidsmap InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108313 Vul de veiligheidsmap aan met informatie over chemicalien die er nog niet in staan.
Doe de paginas met informatie over alle stoffen voor dit experiment vooraan in de map.

Correct gebruik van de veiligheidsmap wordt beoordeeld bij professionele werkhouding en tijdens de praktijktoets.]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108313 13 Pipetteerschema agarosegel InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108315 Vul hier het pipetteerschema voor een 2% agarosegel in

                                        
Agarose                               g
TAE                                       ml
eindvolume                          ml

ul DNA dye toevoegen .... ul]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108315 14 Pipetteerschema monsters bereiden uit mastermix InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108316 Noteer hier hoe je het DNA verdunt voor het experiment en vervolgens monsters bereid uit de mastermix

De precieze concentratie van gekocht DNA weet je niet. Noteer dus echt de berekening in het labjournaal zodat je het op het lab kan overdoen met de concentratie die op het epje staat.

In de voorbeeldberekening is uitgegaan van een DNA concentratie van 34 ng/ul.

De concentratie humaan DNA is waarschijnlijk ongeveer 100-200 ng/ul. Het kan dus dat je het nog moet verdunnen voor je het kan gebruiken.

ul mastermix             ul DNA
...                                   ...

Berekening: ...

]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108316 18 Overzicht labdag / planning InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108317 Het kan handig zijn om een planning te bedenken om overzicht te houden over de labdag. Uiteindelijk op de praktijktoets word gekeken of je weet wat je moet doen, of dat in je hoofd zit of op papier mag je zelf bepalen.

Stappen die in je planning kunnen staan zijn bijvoorbeeld:
  • Materialen verzamelen
  • Gelplek inrichten
  • Epjes beschrijven
  • agarosegel oplossing maken
  • agarosegel gieten
  • agarosegel laten stollen
  • DNA verdunningsreeks maken
  • Loading dye toevoegen aan DNA monsters
  • DNA monsters in de gel doen
  • Gel runnen (stroom erop zetten)
  • Resultaten bekijken op safe imager (blauwe lichtbak) en fotograferen
  • Opruimen

]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108317 Labjournaal InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108319 Opzet voor het labjournaal
Noteer bij verleden het experiment waarin je je eigen DNA hebt geisoleerd]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108319 9 Keuze welke monsters bereid je uit welke mastermix InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108322 Noteer hier welk monster je bereidt uit welke mastermix

Deze info hoeft niet in je labjournaal, maar je moet het wel weten om te bepalen welke mastermixen je gaat maken en voor hoeveel reacties je elke mastermix maakt

Mastermix bevat alles voor een PCR reactie behalve het DNA. Omdat in de monsterlijst veel monsters met verschillende primers zitten kan je niet 1 mastermix maken.

Inventariseer welke verschillende mastermixen je hebt en welk monster met  welke mastermix gemaakt wordt.


]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108322 10 Pipetteerschema mastermixen 1 primerset InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108323 Je hebt voor dit experiment verschillende mastermixen nodig, noteer hier pipetteerschema's voor de mastermixen waarin 1 primerset gebruikt wordt.

In het voorbeeldpipetteerschema is DNA grijs doorgestreept. Dit wordt genoteerd omdat je de hoeveelheid DNA nodig hebt om het aantal ul demiwater te berekenen, maar bij het bereiden van de mastermix voeg je het DNA nog niet toe.

Inhoud                     1 reactie (ul)         ___ reacties (ul)
template DNA
demiwater
PCR buffer
BSA
dNTPs
primer F
primer R
taq polymerase

]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108323 15 Pipetteerschema loading dye InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108324 Noteer hier het pipetteerschema voorhet toevoegen van loading dye aan de DNA monsters voor je ze op gel zet

Loading dye heeft een concentratie van 6x. Je wilt een eindconcentratie van 1x en een eindvolume van 12 ul.

loading dye ..............ul
DNA ..........................ul
eindvolume .........12 ul ]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108324 17 Apparaatinstellingen InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108325 Noteer hier instellingen voor te gebruiken apparatuur

PCR: noteer het programma

Agarose gelelectroforese: noteer het voltage dat je wilt gebruiken, hoelang je schat dat het duurt en hoe ver de loading dye gerund moet zijn voor je stopt (is de gele, paarse of blauwe band onderaan de gel)

Tip: een 2% gel runt veel langzamer dan een 0,7% gel. Hoe hoger het voltage, hoe sneller de gel runt, maar ook hoe slechter de bandjes gescheiden worden.


PCR programma: 
....................................................................


Agarose gel instellingen: 
....................................................................]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108325 Overzicht experiment InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108326 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108326 vragen InhollandLSC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108328 ..]]> 2023-02-06 14:04:03 UTC https://padlet.com/InhollandLSC/iv7h3shyu3q7mr3w/wish/2470108328