También sólo en copias sobrevivió otra gran obra de este periodo: Leda y el cisne. Sin embargo, la cumbre de esta etapa florentina (y una de las pocas obras acabadas por Leonardo) fue el retrato de Mona (abreviatura de Madonna) Lisa Gherardini, esposa de Francesco del Giocondo, razón por la que el cuadro es conocido como La Mona Lisa o La Gioconda. Obra famosa desde el momento de su creación, se convirtió en modelo de retrato y casi nadie escaparía a su influjo en el mundo de la pintura. Como cuadro y como personaje, la mítica Gioconda ha inspirado infinidad de libros y leyendas, y hasta una ópera; pero es poco lo que se conoce a ciencia cierta. Ni siquiera se sabe quién encargó el cuadro, que Leonardo llevaría consigo en su continua peregrinación vital hasta sus últimos años en Francia, donde lo vendió al rey Francisco I por cuatro mil piezas de oro.

El nuevo hombre fuerte de Milán era entonces Gian Giacomo Trivulzio, quien pretendía retomar para sí el monumental proyecto del «gran caballo», convirtiéndolo en una estatua funeraria para su propia tumba en la capilla de San Nazaro Magiore; pero tampoco esta vez el monumento ecuestre pasó de los bocetos, lo que supuso para Leonardo su segunda frustración como escultor. En 1513 una nueva situación de inestabilidad política lo empujó a abandonar Milán; junto a Melzi y Salai marchó a Roma, donde se albergó en el belvedere de Giuliano de Médicis, hermano del nuevo papa León X.

El gran respeto que le dispensó Francisco I hizo que Leonardo pasase esta última etapa de su vida más bien como un miembro de la nobleza que como un empleado de la casa real. Fatigado y concentrado en la redacción de sus últimas páginas para el nunca concluido Tratado de la pintura, cultivó más la teoría que la práctica, aunque todavía ejecutó extraordinarios dibujos sobre temas bíblicos y apocalípticos. Alcanzó a completar el ambiguo San Juan Bautista, un andrógino duende que desborda gracia, sensualidad y misterio; de hecho, sus discípulos lo imitarían poco después convirtiéndolo en un pagano Baco, que hoy puede verse en el Louvre de París.

El 2 de mayo de 1519 murió en Cloux; su testamento legaba a Melzi todos sus libros, manuscritos y dibujos, que el discípulo se encargó de retornar a Italia. Como suele suceder con los grandes genios, se han tejido en torno a su muerte algunas leyendas; una de ellas, inspirada por Vasari, pretende que Leonardo, arrepentido de no haber llevado una existencia regida por las leyes de la Iglesia, se confesó largamente y, con sus últimas fuerzas, se incorporó del lecho mortuorio para recibir, antes de expirar, los sacramentos.