O glicogénio, um polímero ramificado de glicose, atua como reserva de energia e carbono em muitas espécies de bactérias a mamíferos. Em L. acidophilus, o armazenamento e a mobilização de glicogénio são vitais para a sobrevivência em condições de escassez de nutrientes e também desempenham um papel importante na adaptação ambiental e no desempenho metabólico. A Alpha-1,4 glucan phosphorylase é uma das enzimas chave neste processo, sendo regulada por sinais metabólicos e pela disponibilidade de glicogénio no ambiente celular. Estudos prévios sugerem que a regulação dessa enzima é central para a otimização do metabolismo energético em condições de flutuações ambientais.

A proteína codificada pelo gene glgD funciona como a subunidade reguladora da enzima Glucose-1-phosphate adenylyltransferase em, que é formada por duas subunidades, sendo a subunidade catalítica codificada pelo gene glgC. A enzima Glucose-1-phosphate adenylyltransferase promove a transformação de glicose-1-fosfato e ATP em ADP-glicose e pirofosfato, sendo um passo vital na rota de síntese do glicogénio.

Molecularmente, a subunidade reguladora GlgD controla a atividade da ADP-glicose pirofosforilase, respondendo a sinais metabólicos que indicam a necessidade de síntese ou degradação de glicogénio. Esta regulação garante que a bactéria preserve quantidades apropriadas de glicogénio, possibilitando a sua adaptação a mudanças no ambiente e das fontes de nutrientes disponíveis.

Gene ID: 93290190

UniProt ID: Q5FL66

• Gene: glgD

• Organismo: Lactobacillus acidophilus

• Hospedeiro: Homo sapiens

• Localização: complemento(1,144,439..1,145,581)

• Comprimento: 1.143 nt

Proteína:

• Nome: glucose-1-phosphate adenylyltransferase subunit GlgD

• ID: WP_003546573

• Comprimento da proteína: 380 aa

O gene glgB codifica uma proteina que faz parte de um grupo de genes que regulam a formação de moléculas de glicogénio, este em particular, cliva porções do alfa-1,4-glucan que utiliza através da catalisação de ligações alfa-1,6-glucosidicas permite a junção destas, a moléculas de glucose ramificando a molecula e formando a estrutura do glicogénio em L. acidophilus.

Estas ramificações aumentam a solubilidade e a mobilidade da molécula da glicose facilitando a sua disponibilidade e utilização quando esta se torna necessária.

A regulação do gene glgA em L. acidophilus está intimamente ligada ao estado nutricional da célula e às condições ambientais. A expressão do gene é regulada principalmente ao nível transcripcional, incluindo mecanismos como a repressão catabólica por carbono (CCR), mediada pela proteína CcpA (Catabolite Control Protein A). Em condições de abundância de glucose, a expressão do glgA é geralmente reprimida, enquanto em situações de limitação de carbono, a sua expressão é ativada.

Esta bactéria é uma espécie presente no trato intestinal e as suas funções correspondem à produção de metabolitos e regulação do microbioma intestinal (Tegegne & Kebede, 2022). A L. acidophilus consegue regular o balanço da flora intestinal através da redução do pH intestinal e produzindo metabolitos: o pH ótimo de muitas bactérias intestinais patogénicas é neutra ou levemente alcalino. Desta forma o ácido láctico produzido pelo metabolismo da L. acidophilus é capaz de reduzir o pH do meio, inibindo o crescimento e reprodução das bactérias patogénicas (Bennett & Eley, 1976).

A L. acidophilus foi o primeiro microorganismo probiótico onde se demonstrou que possuía uma via biossintética do glicogénio funcional. A via metabólica do glicogénio em L. acidophilus é codificada por uma região cromossomal de 11.7 kb, constituída pelos genes glgBCDDAP-amy-pgm (Goh & Klaenhammer, 2013). Estes 7 genes são co-transcritos como um mRNA policistrónico e o cluster de genes é designado como operão glg (Goh & Klaenhammer, 2014). Deste operão fazem parte os genes glgA (glicogénio sintase), glgD (subunidade regulatória da glucose-1-fosfato adenililtransferase (glgC)), glgB (codifica para a enzima de ramificação de 1,4-a-glucano) e o glgP (glicogénio fosforilase) (Goh & Klaenhammer, 2014). Estes genes foram escolhidos como alvo de estudo no nosso trabalho e a par com os genes glgC (glucose-1-fosfato adenililtransferase catalítica), amy (α-amilase) e pgm (fosfoglucomutase) constituem o operão glg na L. acidophilus.

• Gene: SO785_RS05220

• Organismo: Lactobacillus acidophilus

• Hospedeiro: Homo sapiens

• Localização: complemento(1140569...1142980)

• Comprimento: 2412 nt

Proteína:

• Nome: glicogenio/amido/alfa-glucano fosforilase

• ID NCBI: WP_003546577

• ID Uniprot: Q5FL64_LACAC

• EC 2.4.1.1

• Tamanho da proteína: 803 aa

• Gene: glgB

• Organismo: Lactobacillus acidophilus

• Hospedeiro: Homo sapiens

• Localização: complemento(1146732...1148647)

• Comprimento: 1916 nt

Proteína:

• Nome: 1,4-alpha-glucan branching protein

• ID: WP_011254224.1

• Comprimento da proteína: 638 aa

Características Gerais:

• Localização do gene: cromossoma com ID NZ_CP139575.1

• Tamanho da sequência de DNA 1431 pares de bases

• Origem: gene proveniente da estirpe ATCC 4356 de Lactobacillus acidophilus

• Organismo hospedeiro: Homo sapiens

Informações da Proteína (GlgA):

• ID da proteína: WP_003546574.1

• Comprimento: 476 aminoácidos

• Nome completo: Glycogen synthase (GlgA)

• Função enzimática: EC 2.4.1.21 (alpha-1,4-glucan glucosyltransferase)

• Atividade molecular (GO): GO:0004373 - atividade de α-1,4-glucano glucosiltransferase

Anotações Funcionais:

• Predição baseada em homologia de proteínas

• Inferência por coordenadas similares à sequência WP_007125248.1

• Produto final anotado como "glycogen synthase GlgA"

• Gene envolvido na síntese de glicogénio

Informações Taxonómicas:   

• Bacteria > Bacillati > Bacillota > Bacilli > Lactobacillales > Lactobacillaceae > Lactobacillus

Identificadores do Gene:

• Locus tag: SO785_RS05225

• GeneID: 93290189

• A proteína apresenta um tipo globular, ou seja, apresenta uma estrutura globular e esférica;

• Toda a sequência é classificada como estando dentro, indicando que a proteína é predominantemente citoplasmática e não contém regiões transmembranares;

• As probabilidades mostram que a classificação como dentro ao longo de toda a sequência tem alta confiança (probabilidade de 1), confirmando a ausência de segmentos transmembranares ou localizações extracelulares.

Com base na informação obtida no DeepTMHMM, a proteína não possui domínios transmembranares e é altamente provável que seja uma proteína globular localizada no citoplasma. Essa característica é consistente com muitas enzimas metabólicas, como a Alpha-1,4 glucan phosphorylase, que normalmente operam em ambientes intracelulares.

• Proteína classificada como citoplasmática com um score de 7,50 (bastante elevado), indicando alta confiança na previsão efetuada;

• Localização na membrana citoplasmática: 1,15 (baixa possibilidade);

• Localização na parede celular: 0,62 (baixa possibilidade);

• Localização extracelular: 0,73 (baixa possibilidade);

• Motifs: Não foram encontrados.

A proteína Alpha-1,4 glucan phosphorylase é prevista como citoplasmática sendo que desempenha sua função no interior da célula, onde o glicogénio é armazenado e mobilizado. A informação obtida a partir do software PSORTb é consistente com o papel metabólico e com a classificação da proteína como globular e suporta os dados de DeepTMHMM.

• Predominam regiões de azul, indicando confiança elevada para a estrutura apresentada;

• Não existem áreas de tons amarelos ou laranjas sugerindo ausência de regiões desordenadas ou de difícil modelagem.

Assim, a maior parte da estrutura apresenta altos valores de confiança (pLDDT > 90), indicando que as regiões centrais da proteína são estruturalmente bem definidas e estáveis.

• Fosforilação na treonina (T):

  • Posição 51 (T):

    • Score: 0.543

    • Quinase Principal: Não especificada (unsp)

  • Posição 88 (T):

    • Score: 0.526

    • Quinase Principal: Não especificada (unsp)

• Fosforilação na serina (S):

  • Posição 74 (S):

    • Score: 0.694

    • Quinase Principal: Não especificada (unsp)

  • Posição 142 (S):

    • Score: 0.732

    • Quinase Principal: Não especificada (unsp)

  • Posição 223 (S):

    • Score: 0.805

    • Quinase Principal: Não especificada (unsp)

• Fosforilação na tirosina (Y):

  • Posição 112 (Y):

    • Score: 0.673

    • Quinase Principal: Não especificada (unsp)

  • Posição 378 (Y):

    • Score: 0.791

    • Quinase Principal: Não especificada (unsp)

• A proteína exibe uma estrutura globular, ou seja, apresenta uma conformação esférica;

  
  

• A sequência completa é classificada como "dentro", o que sugere que a proteína é predominantemente citoplasmática e não contém regiões transmembranares;

  
  

• A elevada probabilidade associada a essa classificação ao longo de toda a sequência (probabilidade de 1) reforça a inexistência de segmentos transmembranares ou localizações extracelulares.

  
  

Tendo em conta a análise realizada pelo Deep TMHMM, podemos concluir que a proteína em questão não apresenta domínios transmembranares, tendo uma alta probabilidade de ser uma proteína globular localizada no citoplasma. Isto vai de encontro com a função da proteína uma vez que o metabolismo do glicogênio ocorre no citoplasma, portanto é de esperar que a proteína glgD esteja principalmente no citoplasma.

• A proteína apresenta um tipo globular, ou seja, apresenta uma estrutura globular e esférica;

• Toda a sequência é classifica como estando inside, indicando que a proteína atua predominantemente no espaço intracelular e não contem regiões transmembranares;

• As probabilidades mostram que a classificação ao longo de toda a sequencia tem alta confiança (probabilidade de 100%), confirmando a ausência de segmentos transmembranares ou localizações extracelulares.

• Como para todas analises o resultado foi “Unknown” e os scores para cada uma das localizações possíveis e 2.5, menor que 5.0, não é possível obter nenhuma conclusão quanto a localização subcelular da proteína

• Predominam regiões de azul (pLDDT > 70) indicando confiança elevada para a estrutura apresentada;

• Pequenas partes da estrutura estão em vermelho ou amarelo (pLDDT < 70), representando baixa confiança nom modelo, o que nos indica que estas poderão ser zonas de maior mobilidade e propensas a interações dinâmicas com outras moléculas;

É possível observar um elevado numero de α-hélices, estas estruturas indicam que a proteína é estável e estruturada, as estruturas com menor confiança ilustradas no modelo vão de encontro com a função relatada da proteína, pois esta participa na formação da estrutura do glicogénio através da alteração de outras moléculas

Os dados obtidos por meio da ferramenta Cell-PLoc 2.0 são consistentes com o papel metabólico da proteína uma vez que a síntese e degradação do glicogénio ocorrem no citoplasma.

• Predominância de regiões azuis, o que indica uma confiança elevada (pLDDT > 90) na precisão da estrutura prevista, sugerindo que as regiões centrais da proteína são estruturalmente bem definidas e estáveis.

• Poucas regiões amarelas e laranjas, que correspondem a áreas com menor confiança.

Além disso, a estrutura terciária da proteína mostra uma combinação equilibrada de alfa-hélices e folhas beta pregueadas, conferindo uma arquitetura tridimensional estável e funcional.

• Através da utilização da ferramenta MEME (Multiple EM for Motif Elicitation), nesta imagem podemos ver vários MOTIFS que podem estar associados a funções biológicas especificas como regulação, interação entre proteínas, formação de estruturas secundarias e terciarias entre outras.

• Obtemos um p-value geral de 6.15e-49, este é um valor bastante baixo o que indica uma elevada significância dos MOTIFS encontrados.

• É possível observar que o local de iniciação de alguns dos MOTIFS coincide com os locais previstos para fosforilação pelo NetPhosBac reforçando a importância que este processo terá na regulação da atividade desta proteína.

• LBA1437, LBA062, gtfA – Proteínas especificas do organismo;

• glgA, glgB, glgC, glgD, amyX, LBA0687, LBA0685(glgP, SO785_RS05220) – Proteínas envolvidas no metabolismo do glicogénio presentes do operão glg.

Este operão consiste num cluster de 7 genes, glgBCDAP-amy-pgm de 11.7 kb que para além dos descritos neste trabalho (glgA, glgB, glgD e SO785_RS05220 (LBA0685)) é possível observar o glgC, codifica a enzima Glucose-1-phosphate adenylyltransferase, amyX, pertence á família glycosyl hydrolase 13 e o pgm (LBA0687), uma Phosphoglucomutase.

Este operão é considerado como Policistrónico, é constituído por um conjunto de genes organizados em sequência no genoma e transcritos juntos como uma única molécula de RNA mensageiro (mRNA). Este tipo de organização é típico em procariotas e permite que múltiplos genes relacionados sejam regulados e expressos de forma coordenada.

Distribuição ao Longo da Sequência: Múltiplos locais possíveis de modificação pós-translacional em toda a proteína.

A enzima pode ser fosforilada em vários locais, especialmente nos resíduos de serina.

Na realização da análise BLAST, o nosso grupo recorreu à utilização de scripts desenvolvidos pelo Grupo 4. Reconhecemos e agradecemos o contributo deste grupo, assegurando que os devidos créditos são devidamente identificados nesta secção.

Os resultados da pesquisa BLAST revelaram que as proteínas homólogas identificadas pertenciam exclusivamente a espécies do género Lactobacillus, particularmente a Lactobacillus acidophilus. Esta observação sugere que o gene glgD pode ser altamente específico para este género, indicando uma possível especialização funcional no metabolismo do glicogénio. A ausência de homólogos em outros géneros bacterianos reforça a ideia de que a glucose-1-phosphate adenylyltransferase desempenha um papel crucial e potencialmente único no metabolismo energético de Lactobacillus.

A conservação deste gene em Lactobacillus pode estar diretamente relacionada com a sua capacidade de sobreviver e persistir no trato gastrointestinal humano. A síntese de glicogénio, mediada por enzimas como a GlgD, permite que estas bactérias armazenem energia sob a forma de glicogénio, que pode ser mobilizado em condições de escassez de nutrientes ou durante períodos de stresse, como a exposição à bílis ou a pH ácido. Além disso, a capacidade de metabolizar glicogénio pode contribuir para a utilização eficiente de carboidratos complexos presentes no ambiente gastrointestinal, conferindo uma vantagem competitiva a Lactobacillus na colonização e persistência neste nicho ecológico.

Portanto, a presença exclusiva do gene glgD em Lactobacillus não só destaca a sua importância funcional no metabolismo energético deste género, mas também sugere que esta enzima pode ser um fator chave para a adaptação e retenção de Lactobacillus no trato gastrointestinal humano, reforçando o seu papel como microrganismo probiótico.

A presença do glgD está possivelmente relacionada à capacidade de armazenamento e mobilização de glicogênio, um fator importante para a sobrevivência em ambientes desafiadores, como o trato gastrointestinal. Essa característica pode conferir vantagens competitivas, permitindo a adaptação a condições como escassez de nutrientes, pH ácido e exposição à bile, favorecendo a colonização intestinal e reforçando o papel de Lactobacillus acidophilus como um microrganismo probiótico.