La morfología  de la bacteria es visible debido a que los colorantes utilizados en el proceso tiñen la superficie permitiendo cambiar de color a las bacterias, esto ayuda a tener una definición clara al momento de observar en el microscopio óptico.

Esta tinción requiere de más de un tipo de colorante, consiste en tres pasos fundamentales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas las células en la tinción; después se procede a la decoloración, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, este tiñe las células que se decoloraron.

Los colorantes más utilizados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro del portaobjeto limpio. 
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. 
Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea 
que quede bastante extendida para facilitar el secado.
3. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. 
4. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución 
de no calentar demasiado el portaobjeto pues las células pueden deformarse o romperse.

1. Cubrir la preparación con cristal violeta durante 1 minuto. 2. Decantar el colorante y lavar suavemente con agua 
3. Cubrir con Lugol por 1 minuto lavar suavemente con agua 4. Decolorar con alcohol-acetona. Hasta que la preparación deje de perder color (30 segundos). 
5. Cubrir con safranina por 30 segundos. 
6. Remover suavemente el exceso con agua corriente. 
7. Drenar el frotis y secarlo al aire en posición vertical o subvente con papel filtro.
 8. Limpiar el reverso. 
9. Examinar al microscopio con objetivo de inmersión (100X), usando aceite de inmerción. 

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido o poblaciones celulares.
Las tinciones principales son la de Gram y de Ziehl-Neelsen, ambas diferenciales; aunque también hay otras tinciones diferenciales y selectivas de interés para la microbiología.

Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, sobre la forma, tamaño y agrupación celular. 
La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos según el tipo y composición de la pared que presentan:
-  Bacterias con pared de tipo Gram positiva
-  Bacterias con pared de tipo Gram negativa. 

Aparte de estos colorantes, en la tinción de Gram se usará el lugol como mordiente, y alcohol 96% para decolorar. Todas las células (sean Gram positivas o negativas) se teñirán con el cristal violeta.
Ahora bien, el alcohol quita fosfolípidos y cierra los poros de la pared celular, por lo que el cristal violeta queda atrapado. Las bacterias gram positivas podrán soportar este proceso gracias a su gran capa de peptidoglicano. No obstante, las bacterias Gram negativas no aguantarán este tratamiento con alcohol, por lo que se quitará el cristal violeta de ellas