Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco específica y corta el ADN en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar, muchas enzimas de restricción producen extremos de cadena sencilla cortos que sobresalen. Si dos moléculas tienen extremos sobresalientes que se empatan, pueden complementar sus bases y unirse. Sin embargo, no se combinan para formar una molécula de ADN completa hasta que la ADN ligasa las une sellando los espacios en el esqueleto del ADN.

Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen en un plásmido. Con ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente elegida, se realiza lo siguiente:

Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar un plásmido recombinante que contenga el gen.

2) Necesitamos obtener toda la secuencia codificante para clonarla en un plásmido.

A continuación, cuando hayamos elegido la secuencia que queremos  amplificar, vamos a cualquiera de los 2 programas  e introducimos la secuencia en la ventana principal ahí podemos elegir propiedades que nos  interesen en nuestros primers.
para finalizar ahí nos va a dar los mejores primers que haya podido encontrar.

El ADN duplex es separado en cadenas simples cuando la temperatura a la que se somete es de 94° C.

Cebadores cortos de ADN (de 15 a 20 pares de bases) se agregan a la mezcla para  provocar que se unan mediante puentes de hidrógeno a las cadenas individuales de ADN a 54° C.

Se agrega ADN polimerasa que cataliza la producción de cadenas nuevas complementarias en dirección 5´→ 3´. La replicación ocurre cuando  la temperatura desciende a 72° C.

Las células capaces de crecer en un medio de cultivo con este antibiótico, serán las que han sido transformadas por el plásmido, y las células que no puedan crecer carecerán de este.

Mediante el uso de ATP como fuente de energía, la ligasa cataliza una reacción en la que el grupo fosfato del extremo 5' de una cadena de ADN se une al grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra cadena. 

 Al cortar y pegar ADN, es posible la formación de productos secundarios, puede haber casos donde el plásmido se cierra en su forma original o casos donde el gen está en dirección inversa.

Debido a estas posibilidades, es importante recolectar ADN plasmídico de cada colonia y comprobar si coincide con el plásmido que intentábamos construir. Para analizar el ADN plasmídico de colonias bacterianas, se utiliza digestión con enzimas de restricción, PCR y secuenciación de ADN

International.neb.com
También existen otros portales como son NEBcutter V2.0 
Con esta herramienta podemos verificar los sitios de corte para enzimas de restricción de un inserto o un plásmido, solo tienes que obtener y copiar la secuencia de una base de datos y colocarla en el ventana del programa.