Excitación de pedido más alto

La absorción simultánea de tres o más fotones también es posible, teniendo en cuenta de tres fotones o microscopia de excitación del multifotón.

Fluorophores el más comúnmente usados tienen espectros de excitación en el 400–500 nm variedad, mientras que el láser usado para excitar la fluorescencia de dos fotones está en el ~700–1000 nm variedad (infrarroja). Si el fluorophore absorbe dos fotones infrarrojos simultáneamente, absorberá bastante energía para levantarse en el estado excitado. El fluorophore emitirá entonces un fotón solo con una longitud de onda que depende del tipo de fluorophore usado (típicamente en el espectro visible). Como dos fotones se absorben durante la excitación del fluorophore, la probabilidad para la emisión fluorescente de los aumentos de fluorophores cuadráticamente con la intensidad de excitación. Por lo tanto, la fluorescencia mucho más de dos fotones se genera donde el rayo láser fuertemente se enfoca que donde es más difuso. Con eficacia, la excitación se restringe al volumen focal diminuto (~1 femtoliter), causando un alto grado del rechazo de objetos desenfocados. Esta localización de la excitación es la ventaja clave comparado con microscopios de excitación del fotón solo, que tienen que emplear elementos adicionales como agujeros de alfiler para rechazar la fluorescencia desenfocada. La fluorescencia de la muestra es coleccionada entonces por un detector de sensibilidad alta, como un tubo del fotomultiplicador. Esta intensidad de la luz observada se hace un pixel a la imagen eventual; el foco se explora en todas partes de una región deseada de la muestra para formar todos los pixeles de la imagen.

El uso de luz infrarroja para excitar fluorophores en el tejido de dispersión de la luz ha añadido ventajas. Las longitudes de onda más largas se dispersan a un grado menor que más corto, que es una ventaja para la representación de alta resolución. Además, estos fotones de la energía inferior con menor probabilidad causarán daño fuera del volumen focal. Comparado con un microscopio confocal, el descubrimiento del fotón es mucho más eficaz ya que hasta los fotones dispersados contribuyen a la señal utilizable. Estas ventajas para la representación en tejidos que se dispersan sólo se reconocieron varios años después de la invención de la microscopia de excitación de dos fotones. Hay varias advertencias a la utilización de la microscopia de dos fotones: Los lásers pulsados necesarios para la excitación de dos fotones son mucho más caros que los lásers de onda continua (CW) usados en la microscopia confocal. El espectro de absorción de dos fotones de una molécula puede variar considerablemente de su equivalente de un fotón. Para objetos muy delgados como células aisladas, el fotón solo (confocal) microscopios puede producir imágenes con la resolución óptica más alta debido a sus longitudes de onda de excitación más cortas. En el tejido que se dispersa, por otra parte, el seccionamiento óptico superior y las capacidades de descubrimiento ligeras del microscopio de dos fotones causan el mejor rendimiento.