Voor het doel staan vaak hints in de opdracht tekst

Welke vraag beantwoord je met je analysemonster? Wat weet je over het aangeleverde DNA als je dit experiment hebt uitgevoerd? Noteer dit in je labjournaal

Het doel van dit experiment is Van lambda dna monster, meer lambda dna maken

Kader:

Het J-gen van lambda DNA is onderdeel van de central tail fiber en is betrokken bij hechting van het virion aan een host cell. Je supervisor wil lambda DNA gebruiken als vector om genen in bacteriën tot expressie te brengen en wil het proces van virusbinnenkomst in de bacterie efficiënter maken. Hiervoor heeft je supervisor puntmutaties aangebracht bij het nucleotide op bp 15789 van lambda DNA. Het J gen wordt gecodeerd van basenpaar 15505 t/m 18903 op het genoom van lambda DNA. 

Jouw deel:

Om te onderzoeken of het geïsoleerde lambda DNA wildtype of de gewenste mutant is ga jij dit analyseren met PCR. De primers zijn zo gekozen dat de verwachte mutatie aan het eind van de forward primer zou moeten zitten. Primer Lambda_J_wt_F: gacggtgctgggtacggaagtgaaa herkent wildtype lambda DNA en kan niet binden als een mutatie gacggtgctgggtacggaagtgaax aanwezig is, er wordt dan ook geen PCR product gevormd (x is een notatie die betekent dat ere een willekeurige base aanwezig kan zijn). Bij snapgene (link) kan je een kaart van het genoom van lambda DNA inzien.

In p3 vaardigheden ga je alleen het PCR deel van dit experiment uitvoeren, er is dus geen vervolg. Je gaat door een PCR op lambda DNA uit te voeren analyseren of je analysemonster wildtype lambda DNA is of dat je analysemonster een puntmutatie bevat. De resultaten analyseer je op agarosegel.

Gebruik controles om te bepalen of je PCR goed werkt (geeft het altijd een product bij wildtype lambda DNA, geeft het niet per ongeluk producten wanneer er geen wildtype lambda DNA aanwezig is) en kies een ladder die informatief is bij de grootte van het PCR product dat je verwacht te zien.

Voorspel van tevoren digitaal het resultaat van de PCR met BLAST om een goede verwachting op te kunnen stellen.

Op het lab zijn de volgende specifieke materialen aanwezig:

• Primers: 

  • Lambda_J_wt_F: 5’ gacggtgctgggtacggaagtgaaa 3’

  • Lambda_J_wt_R: 5’ gttccataccggcatacagcgcatc 3’

• Positieve controle: wildtype lambda DNA

• Negatieve controle: escherichia phage T4 DNA

• 2 Analysemonsters: lambda DNA met of zonder puntmutatie

• Standaard reagentia  voor PCR en agarose gelelectroforese

Bedenk eerst de concentratie en het eindvolume

0,7%

Agarose                 0,35              g

TAE                                     50  ml

eindvolume                         50 ml

ul DNA dye toevoegen 2 ul

In het voorbeeldpipetteerschema is DNA grijs doorgestreept. Dit wordt wel genoteerd omdat je de hoeveelheid ul DNA nodig hebt om het aantal ul demiwater te berekenen, maar bij het bereiden van de mastermix voeg je het DNA nog niet toe.

Wanneer je in dit experiment kiest voor 2 analysemonsters, 1 positieve controle met lambda DNA en lambda primers, 1 negatieve controle met primers en geen DNA en 1 negatieve controle met DNA, maar geen primers, dan maak je dus een mastermix voor 2 analyse + 1 pos ctrl + 1 neg ctrl zonder DNA + 1 overmaat --> dit is dus voor 5 reacties. De hoeveelheden voor 1 reactie doe je dan *5.

Inhoud                     1 reactie (ul)         ___ reacties (ul)

template DNA x

demiwater x

PCR buffer 5

BSA

dNTPs (0,2mM) 1 (0,2pM)

primer F 1 (0,2pM)

primer R 1 (0,2pM)

taq polymerase (1x) 0,2 (als 5U/ul)

tot vol 50

• Bedenk dat het PCR-programma veel cycli heeft, bereken hoe lang het duurt voordat het hele programma afgerond is. Reken daar nog 20% tijd bij omdat het apparaat tussen elke stap moet opwarmen of afkoelen
• Bedenk dat runnen van gel elektroforese ook tijd kost, langer dan de vorige weken wanneer je een hoger % agarosegel gebruikt. Beschrijf welke kleur uit de loading dye hoe ver gerund moet zijn wanneer je de gel wilt stoppen

• Materialen verzamelen
• Gelplek inrichten
• Epjes beschrijven
• agarosegel oplossing maken
• agarosegel gieten
• agarosegel laten stollen
• PCR runnen (... tijd)
  • Bereken dit en bedenk een deadline (hoe laat wil je dat het apparaat uiterlijk aan gaat)
• Loading dye toevoegen aan DNA monsters
• DNA monsters in de gel doen
• Gel runnen (stroom erop zetten)
• Resultaten bekijken op safe imager (blauwe lichtbak) en fotograferen
• Opruimen

Noteer hier de onderbouwde verwachting van het experiment
Noteer je verwachting over:

• Het analysemonster wanneer het wiltdtype lambda DNA bevat (wel of geen bandje, hoeveel bp is het bandje) 

• Het analysemonster wanneer het een puntmutatie bevat (wel of geen bandje, hoeveel bp is het bandje) 

• Elke controle (wel of geen bandje, hoeveel bp is het bandje) 

  • ^{Dit kan natuurlijk pas wanneer je de controles bedacht hebt}

Onderbouw je verwachting met prinscreen-plaatjes van de BLAST resultaten (in silico-versie van het experiment). Je kan het organisme in BLAST instellen als lambda DNA of zelf de lambda DNA sequentie in BLAST plakken.

Kies aan de hand van de verwachte resultaten een geschikte ladder en noteer deze bij je monsters.

Benodigde informatie om een verwachting op te stellen:

• DNA sequentie lambda DNA

• Primersequenties

• BLAST (hoe werkt dat)

zonder:

...799bp analyse

met snp:

155000(?) want deze heeft een snp waardoor primer er niet op kan

referentie

50bp of 100 bp

...

...

In de opdracht tekst wordt vaak gehint naar de voorschriften. Kijk naar de opdrachttekst en kijk naar de index van de voorschriften. Als je dezelfde woorden tegenkomt zijn dat vast de benodigde voorschriften. 

Deze week ga je een PCR resultaat digitaal voorspellen, de PCR uitvoeren, het product daarvan op agarosegel analyseren:

• A

• K

• L

Bij een PCR heeft een duplo analysemonster geen meerwaarde

Beschrijf per controle:

• Wat je controleert

• Welk DNA wel of niet in het monster moet

• Welke primers er wel of niet in het monster moeten

• Hoe de uitkomst er uit ziet wanneer het experiment goed verloopt

  • wel / geen bandje

  • Hoeveel bp is een verwacht bandje

In bovenstaand figuur zijn controles gesuggereerd en staat een voorbeeld meetmonster ingevuld. Je mag zelf meer of andere controles uitvoeren als je die nuttig vind, maar het hoeft niet.

Beschrijf in je labjournaal in een overzichtelijke tabel of lijst de monsters en welke DNA ladder je gekozen hebt.

Vul de verwachting aan met verwachtingen voor je controles

analyse: monster zonder snp (799bp dus bandje daar)

neg controle: monster met SNP (50.000bp dus smeer?)

pos controle: ???

analyse: 2 analysemonster met of zonder SNP

neg controle:

-geen DNA

-met mutant DNA

pos controle:

-met wildtype DNA

• Wat wil je bereiken met dit experiment? --> Wat wil je aan het eind van de labdag weten of hebben?
  • ...

• Welke materialen zijn beschikbaar?
  • ...
• Welk DNA ga je gebruiken voor het analysemonster?
  • ...
  • En voor de positieve controle?
  • ...
• Wat is / zijn de sequenties van dat DNA?
  • ...
  • ...
  • Dit staat in het document bij studiematerialen op moodle 'DNA sequenties primers ladders'
• Welke primers ga je gebruiken?
  • ...
  • Wat zijn de sequenties van die primers?
    • ...
    • Dit staat in het document bij studiematerialen op moodle 'DNA sequenties primers ladders'
• Hoe bedenk ik de voorspelling van het resultaat?
  • ...
• Welke voorschriften zijn er nodig?
  • ...

• Verwacht je 0, 1, of meer bandjes?
• Hoe groot is / zijn verwachte bandje(s)?