• Extracción

  Para extraer ácidos nucleicos, se disgregan las células o tejidos, se inactivan las nucleasas y se separan los ácidos nucleicos de los demás componentes celulares. 

• Purificación

  La purificación de ácidos nucleicos puede variar según el tipo de ácido nucleico que se quiera aislar, el grado de pureza requerido y si se usan sustancias tóxicas o inocuas. 

• Detección y cuantificación

  Para detectar y cuantificar ácidos nucleicos se puede usar espectrofotometría UV y de fluorescencia. 

• Análisis

  La pureza de un ácido nucleico se puede evaluar con espectrofotometría UV, electroforesis en gel o PCR cuantitativa.

• Extracción de ADN y ARN :

  • Métodos basados ​​en disrupción celular : Uso de detergentes, enzimas o técnicas físicas (homogeneización, ultrasonido).

  • Purificación : Uso de fenol-cloroformo, columnas de sílice o kits comerciales.

  • Precipitación : Alcohol isopropílico o etanol, con sales como acetato de sodio.

• Análisis de calidad:

  • Espectrofotometría UV : Medición a 260 nm para concentraciones de ácidos nucleicos.

  • Electroforesis en gel : Geles de agarosa o acrilamida para evaluar tamaño e integridad. (1)

Algunas de ellas son:

• Southern blot : Detección de ADN específico.

• Northern blot : Análisis de ARN mensajero (expresión génica).

• FISH (Hibridación in situ fluorescente) : Identificación de secuencias específicas en cromosomas o tejidos, sondas fluorescente.

• Tradicional: enzimas o isotopos radiactivos (2).

• Pasos clave :

  • Aislamiento de ADN de interés : Uso de enzimas de restricción.

  • Inserción en un vector : Plásmidos, fagos o BACs, empleando ligasas.

  • Transformación : Introducción del vector en un organismo huésped (E. coli, levaduras).

  • Selección y expresión : Uso de marcadores selectivos y análisis funcional del gen clonado (3).

    
    

  
  

• Sanger o terminación de la cadena

  Es un método sencillo para secuenciar ADN, que se basa en la acción de las ADN polimerasas. Este método es preciso y reproducible, y se puede utilizar para secuenciar distintos tipos de ADN. 

• Secuenciación automática

  Es otro método para secuenciar ADN. 

• Secuenciación de próxima generación (NGS)

  Es una técnica que permite detectar alteraciones en los genes de las muestras de pacientes con cáncer. 

• Secuenciación química

  Es un método que se originó para estudiar las interacciones entre ADN y proteínas (4)

Diagnóstico de enfermedades genéticas

La PCR permite identificar mutaciones específicas en genes asociados con enfermedades hereditarias.

Aplicaciones principales:

1. Detección de mutaciones puntuales:

2. Diagnóstico prenatal:

   • Detección de anomalías genéticas en el ADN.

3. Análisis de portadores:

   • Evaluación de mutaciones recesivas en parejas con riesgo de transmitir enfermedades.

Métodos específicos:

• PCR convencional: Para detectar mutaciones conocidas.

• PCR en tiempo real (qPCR): Cuantificación de copias de un gen anómalo.

• PCR digital: Alta sensibilidad para mutaciones somáticas en el cáncer.

2. PCR en el diagnóstico de enfermedades causadas por microorganismos

La PCR es ampliamente utilizada para detectar infecciones bacterianas, virales, micóticas y parasitarias.

• PCR convencional : Amplificación específica de fragmentos de ADN de patógenos.

• PCR en tiempo real (qPCR) : Cuantificación de carga viral o bacteriana (ej. VIH, SARS-CoV-2).

• RT-PCR : Conversión de ARN a ADNc para detectar virus de ARN (ej. influenza, dengue).

• Ventajas : Alta sensibilidad, especificidad y rapidez.

• Limitaciones : Requiere equipamiento especializado y controles estrictos para evitar la contaminación. (5)