Verso la fine del Quattrocento, la musica sacra polifonica era divenuta molto complessa, come attestano i lavori di Johannes Ockeghem e Jacob Obrecht in una maniera che riflette con analogie affascinanti la pittura dello stesso periodo.

Sempre all'inizio del Cinquecento gli eccessi della scuola fiamminga nel secolo precedente provocarono una reazione e una nuova tendenza alla semplificazione, come si può vedere nell'opera di Josquin Des Prez e dei suoi contemporanei fiamminghi e, più tardi, nell'opera di Giovanni Pierluigi da Palestrina, che era, in parte, spinta dalle limitazioni imposte alla musica sacra dal Concilio di Trento che scoraggiava l'eccessiva complessità. Le complessità dei canoni quattrocenteschi furono progressivamente abbandonate dai fiamminghi in favore dell'imitazione a due e tre voci (fino ad arrivare a sei voci reali) e con l'inserimento di sezioni in omofonia che sottolineavano i punti salienti della composizione. Palestrina, dal canto suo, produsse composizioni in cui un contrappunto fluido alternava fittamente consonanze e dissonanze con un suggestivo effetto di sospensione. La transizione ad un tactus di due semibrevi per breve era a questo punto quasi definitiva e il tre su uno veniva riservato ad effetti speciali volti a sottolineare momenti di tensione, l'esatto opposto della tecnica prevalente cent'anni prima.

Alla fine del secolo, con il trattato De Institutioni Harmonicae del compositore e teorico musicale italiano Gioseffo Zarlino (1589) si definiscono finalmente in modo completo ed esauriente le leggi dell'armonia (e quindi della polifonia). Nasce da qui la definizione dei due modi cardine della musica moderna: i modi maggiore e minore.