Anche l’Impero Ottomano si opporrà a questo tentativo di Carlo con le sue mire espansionistiche in Europa Centrale. Un altro grande problema sarà la forte espansione del Protestantesimo in Germania e poi nel resto d’Europa.

Carlo V fece sposare sua figlia Margherita con il Duca di Firenze e sua nipote Cristina di Danimarca con il Duca di Milano;

Francesco I combinò un matrimonio tra sua cognata e il Duca di Ferrara Ercole II d’Este. Suo figlio Enrico (futuro re di Francia, Enrico II) sposò Caterina de’ Medici, nipote del papa Clemente VII. 

Francesco I incoraggiò il sultano di Costantinopoli ad aprire un conflitto con l’Imperatore per il controllo delle coste africane del Mediterraneo che però fu un fallimento per l’Impero Ottomano. Carlo V dopo la vittoria, si fermò nei possedimenti italiani, passando dalla Sicilia a Napoli e andò a conoscere il nuovo Papa Paolo III, il quale si dichiarò neutrale nello scontro tra Francia e Impero.

Carlo V si impegnò altre due volte contro l’impero Ottomano, in mano al comandante Barbarossa che godeva dell’aperto appoggio di Francesco I ma entrambe le volte ne uscì sconfitto e dovette rinunciare al controllo del Mediterraneo.

Nello stesso anno morì il re Francesco I di Francisa e salì il secondogenito Enrico II. 
Inoltre il Papa spostò il concilio da Trento a Bologna, cercando così di sottrarlo all’influenza dell’imperatore per concentrarsi su temi più teologici.

Nel 1549 morì il Papa Paolo III e successe Giulio III, il quale come ringraziamento dell’elezione a pontefice volle restituire il ducato di Parma ai Farnese.

Per paura di una possibile riconquista da parte di Carlo V, Ottavio Farnese cercò protezione dal re di Francia Enrico II. A questa alleanza si unì anche il Papa. 

Enrico II tentò di conquistare Napoli, che era sotto il controllo di Carlo V e per farlo si alleò nel 1552 con i Turchi. 
Nonostante la sconfitta della flotta imperiale da parte di quella turca Enrico II non riuscì a conquistare Napoli e il tentativo fallì.

In Germania, dopo la vittoria a Mühlberg, Carlo V adottò una politica estremamente rigida nei confronti dei principi protestanti, i quali si unirono in una lega e cercarono l’appoggio di Enrico II contro l’imperatore stesso: l’accordo, stipulato nel 1552, prevedeva aiuto economico per finanziare le truppe della lega e in cambio la riconquista delle città di Verdun, Toul, Cambrai e Metz per la Francia.

Si aprì una guerra con Enrico II ma si concluse con il Trattato di Passavia che vide lo scioglimento dell’alleanza tra i principi protestanti con Enrico II in cambio di libertà religiose. 

Nello stesso anno Carlo V tentò di riconquistare la Lorena alla Francia, iniziando dall’assedio della città di Metz che però fu un fallimento.

Si tratta del principio del “cuius regio eius religio”, il suddito doveva professare la religione professata dal principe del suo Stato.

Questa scelta dell’Impero spinse Papa Paolo IV a cercare un nuovo difensore della Chiesa di Roma e per questo strinse un'alleanza con il re di Francia.

Nel 1556 Carlo V abdicò e divise il regno tra i due successori:

- al fratello Ferdinando la corona imperiale (che gli venne riconosciuta dai principi nel 1558);

- al figlio Filippo II le corone di Spagna, Castiglia, d’Aragona, i Paesi Bassi, la Franca contea e le Nuove Indie, il Ducato di Milano, Regno di Napoli e Sicilia.

Carlo V partì per la Spagna, dove risiedette vicino al monastero di San Jeronimo di Yuste e morì il 21 Settembre 1558, probabilmente di malaria.