1. Choque hipotónico

2. Centrifugación (1200 rpm por 10 minutos), fijación con Carnoy y almacenamiento −20 °C.

3. Preparación de portaobjetos e hibridación con sondas FISH y se contrateñieron con DAPI

4. Hibridación de sondas FISH (hasta 5 por muestra)

• Sonda para deleción de TP53 / centrómero del cromosoma 17

• Sonda dual para IGH/FGFR3

• Sonda dual para IGH/MAF

• Sonda dual para IGH/MAFB

• Sonda para amplificación/deleción CKS1B/CDKN2C (P18)

5. Análisis de núcleos (hasta 200 núcleos por sonda) → referencia para comparar con los datos de OGM

6. Confirmación de translocaciones y clasificación genómica

• Las translocaciones t(11;14) detectadas por OGM → confirmadas con FISH con sonda dual IGH/CCND1

• Muestra 12: no se pudo confirmar la translocación t(6;14) por FISH

• Muestras 01, 30 y 33: evaluadas con sonda D5S23/D5S721/CEP9/CEP15 para confirmar la clasificación como HDM

• Las muestras sin translocaciones IGH canónicas, pero con ganancias recurrentes de cromosomas impares detectadas por OGM, también fueron clasificadas como HDM.

• Genomas no diploides (como triploides o tetraploides) se clasificaron como HDM si se observaron ganancias de cromosomas impares sin translocaciones IGH.

• Se sospechó genoma no diploide si al menos 3 sondas FISH mostraban 3 o más señales por locus.

7. Confirmación de reordenamientos en 8q24.21/MYC

• Se utilizó la sonda MYC breakapart o la sonda tricolor IGH-MYC-CEP8 para confirmar reordenamientos
  

 Optical Genome Mapping

1. Extracción de ADN con Kit de generación 1 y 2

2. Procesamiento inicial y problemas técnicos

Problemas al correr OGM debido a la presencia de microesferas magnéticas en las muestras 01-07.

• Las microesferas causaron obstrucción de chips y fallas en las corridas.

3. Incorporación del paso de eliminación de microesferas, el cual se basaba en el uso de un imán y la recolección del sobrenadante con ADN. El kit de generación 2 resultó ser más eficiente y ofreció mejores resultados.

4. Elución (en 55 μL) y preparación del ADN

5. Marcado y ejecución del OGM

• Se usó entre 620 y 750 ng de ADN

• Todas las muestras fueron corridas en el sistema Saphyr® (#G199, Bionano Genomics).

Se utilizaron chips de nano canales G2.3 (#20366) y G3.3 (#20440)

Análisis OGM (software Bionano Access v1.7.2.)

1. Análisis principal con RVA con el pipeline de análisis de variantes raras (RVA)

2. Criterios esperados de calidad para todas las muestras

• Tasa de mapeo (map rate) esperada: mínimo 70%.

• Cobertura efectiva (coverage): entre 300× y 400×.

• Cantidad de datos genómicos (Gbp): al menos 1500 Gbp por muestra.

3. Análisis complementario para muestras no diploides

En muestras con sospecha de genomas no diploides (01, 12, 33 y 44) según FISH:

• Se usó pipeline de análisis de novo adicional con ~250×

4. Configuración de filtros del RVA (análisis inicial) para eliminar variantes presentes en población normal

5. Verificación adicional para translocaciones IGH no detectadas

En muestras sin reordenamientos IGH detectados automáticamente:

• Se ajustó la confianza a “All” para detectar translocaciones teloméricas como t(4;14) en muestras sin reordenamientos IGH automáticos.

6. Revisión de CNVs no detectados mediante el cambio del filtro de confianza para CNVs a “All”

7. Filtro específico con genes de cáncer para detectar alteraciones clínicamente relevantes en MM

8. Revisión visual del genoma para

   detectar clones pequeños con aneuploidías o deleciones/ganancias debajo del umbral de detección automático.

9. Confirmación de translocaciones IGH

Las translocaciones del locus IGH fueron consideradas positivas si:

• Estaban confirmadas por FISH.

• El punto de ruptura (breakpoint) cerca de un oncogén relevante hasta ~1 Mb de distancia.

10. Clasificación de ganancia vs amplificación en 1q mediante el uso un valor de corte (cut-off) >3 en el fCN

OGM no detecta con precisión niveles de ploidía total (como triploidía o tetraploidía), ya que su análisis estándar (RVA) normaliza todos los genomas a un estado diploide (2n). Esto puede llevar a interpretaciones erróneas de pérdidas genéticas, especialmente en muestras no diploides, como en mieloma múltiple (MM), donde hay tetraploidía en algunos casos. Una alternativa es usar el análisis de novo, que permite identificar ploidías impares (como 3n) mediante variaciones en las proporciones alélicas, pero no detecta ploidías pares (como 4n). Además, este método requiere más recursos y tiempo (~24 horas por muestra).

Detección de la deleción de 17p/TP53

OGM detectó deleciones del gen TP53 en todas las muestras que fueron positivas por FISH. Cuatro de seis muestras fueron identificadas automáticamente por el software, y las otras dos mediante inspección visual. Al ajustar los filtros del software, se logró detectar una de las dos muestras restantes como deleción. Los valores de frecuencia alélica (VAF) obtenidos por OGM se correlacionaron bien con los porcentajes de células positivas por FISH, aunque con ligeras diferencias normales entre métodos. Las deleciones fueron grandes (7–22 Mb) y abarcaron amplias regiones del brazo 17p, no siendo pequeñas ni focales como en otras enfermedades.

Además, OGM mostró que estas deleciones fueron causadas por reordenamientos estructurales desequilibrados, frecuentemente translocaciones intercromosómicas, y se asociaron con un mayor número de SV y CNV en general. También se observó una frecuente co-ocurrencia de deleción en el brazo 8p. Sin embargo, en muestras con alteraciones en la ploidía, como la muestra 33, OGM puede generar falsos positivos, por lo que se recomienda una técnica de confirmación adicional. Se necesitan más estudios para mejorar la precisión de OGM en la detección de deleciones de TP53.

Anormalidades de 8q24.21/MYC

Se detectaron anomalías en la región 8q24.21 (locus MYC) en el 55% de las muestras (11 de 20). Nueve casos presentaron translocaciones complejas entre MYC e inmunoglobulinas (IGH, IGL) u otros genes, confirmadas por FISH en cinco muestras. En tres casos, FISH fue negativo debido a que las alteraciones eran pequeñas inserciones o inversiones que no separaban las señales. Además, dos muestras mostraron deleciones en lugar de translocaciones: una bialélica (por monosomía 8 y deleción focal del gen PVT1) y otra monoalélica que afectó a MYC y parcialmente a PVT1. Estas alteraciones del locus MYC están relacionadas con mal pronóstico en mieloma múltiple.

• La adición del paso de eliminación de microesferas fue efectivo en la extracción de ADN

• El kit de generación 2 es más eficiente que el dos

La muestra 45 no fue incluida en las métricas por no cumplir con los umbrales mínimos de datos, mapeo y cobertura. Sin embargo, se incluyó en el estudio por detectarse la translocación NSD2::IGH/t(4;14), confirmada por FISH. Solo se analizó esta translocación y una evaluación global de SV y CNV por OGM.

El análisis citogenético, como la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), es el estándar para detectar estas alteraciones. Sin embargo, FISH presenta limitaciones, como la baja sensibilidad en ciertos casos y dificultades en la interpretación debido a la complejidad genética del MM. La secuenciación de próxima generación (NGS) ha permitido identificar variantes genéticas adicionales. Por otro lado, el mapeo genómico óptico (OGM) es una herramienta prometedora que podría superar estas limitaciones y proporcionar una visión más completa de la complejidad genética del MM. El objetivo de este estudio es evaluar el potencial del OGM para detectar aberraciones relevantes en MM y comparar su eficacia con la de FISH.

Las muestras de BMA fueron tratadas con estabilizador de ADN y las células plasmáticas fueron purificadas utilizando un kit de selección de CD138, seguido de un análisis de viabilidad celular. Una vez purificadas, las células plasmáticas se almacenaron a -80°C para la extracción de ADN y análisis genéticos posteriores. Además, se incluyeron muestras de dos pacientes con MM de un banco de células criopreservadas para asegurar la evaluación de las translocaciones IGH más frecuentes. Se utilizaron al menos un millón de células plasmáticas para el análisis de FISH y 1.5 millones para el análisis de OGM. El estudio evaluó las aberraciones genéticas mediante ambos métodos (FISH y OGM) para comparar su eficacia en la detección de alteraciones clave en el MM.