Lactase

2. Justificativa da escolha

A deficiência de lactase é comum em humanos, levando à intolerância à lactose – uma condição relativamente comum que afeta uma parcela significativa da população mundial. Dessa forma, a utilização de lactase exógena, especialmente a obtida de fontes microbianas através de processos fermentativos, permite a produção de alimentos com baixo teor de lactose, que atendem às necessidades dos intolerantes à lactose.

A possibilidade de sua imobilização enzimática permite que ela seja reutilizada em sistemas contínuos, como na produção de leite sem lactose, o que não só diminui os custos de produção como também aumenta a eficiência e a sustentabilidade dos processos industriais. 

3. De onde vem a enzima? 

A enzima é naturalmente encontrada em mamíferos e produzida pelas bordas do intestino delgado, entretanto, devida à perda progressiva da capacidade de produção da enzima pelo organismo, a lactase pode ser extraída a partir de microrganismos como leveduras, por exemplo Kluyveromyces lactis, para fins comerciais.

4. Qual sua classificação e diferentes nomenclaturas? 

A enzima é uma β-galactosidase, da classe das hidrolases (EC 3.2.1.108). Faz a quebra de uma molécula de lactose em moléculas menores, de glicose e galactose, com a participação da água.

Diferentes nomenclaturas: lactase; β-galactosidase

5. Ela tem algum aspecto diferencial?

• Imobilização enzimática: pode ser reutilizada em processos contínuos e de longo prazo (produção de leite sem lactose) = diminuição dos custos e aumenta a eficiência dos processos industriais.

• Várias aplicações: a enzima não é restrita somente a produção de leite sem lactose, pode ser utilizada em bebidas fermentadas e iogurtes. 

Onde a lactase é usada?

• Alimentos

   - Produção de leite e derivados sem lactose.

   - Sorvetes com textura melhor e sem cristais indesejados.

• Saúde

   - Suplementos em cápsulas ou comprimidos para quem consome leite e sente desconforto.

   - Fórmulas infantis para bebês intolerantes.

• Medicamentos

   - Remédios adaptados para pessoas intolerantes.

Como funciona o processo?

1. O leite é preparado (pasteurizado).

2. Adiciona-se a lactase, derivada da fermentação de microrganismos.

3. A enzima age em condições controladas (temperatura e pH) e transforma a lactose em açúcares simples: glicose e galactose.

4. O leite tratado é pronto para consumo ou para virar outro produto, como iogurtes e sorvetes.

O uso da lactase apresenta diversas vantagens:

• Acessibilidade para intolerantes à lactose: Permite o consumo de produtos lácteos sem causar desconfortos gastrointestinais como inchaço, gases e diarreia.

• Melhora do sabor e da textura: A conversão de lactose em glicose e galactose aumenta a doçura natural do produto, reduzindo a necessidade de adoçantes artificiais.

• Valor agregado: Produtos "zero lactose" têm alta demanda e oferecem uma oportunidade de mercado crescente.

A lactase pode ser produzida a partir de diferentes fontes:

• Microrganismos: Como fungos (Aspergillus niger e Aspergillus oryzae) e leveduras (Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces fragilis) entre outros. Essa é a forma mais comum de produção industrial.

• Origem animal: Extraída do intestino delgado de animais, mas essa forma é menos utilizada devido a limitações éticas e custo.

• Engenharia genética: Modificação de microrganismos para aumentar a eficiência de produção. Essa abordagem é considerada uma das mais vantajosas devido à alta produtividade e especificidade.

Entre essas opções, a produção por microrganismos, especialmente aqueles modificados geneticamente, é a mais vantajosa. Esses sistemas são escaláveis, sustentáveis e permitem maior controle sobre as características da enzima.

A enzima é intracelular ou extracelular? 

A lactase é uma enzima geralmente encontrada em meio intracelular, mas em alguns casos pode ser obtida de forma extracelular, dependendo da fonte de obtenção: 

• Em bactérias e leveduras, a enzima lactase é frequentemente intracelular, sendo que desse modo a extração se dá por processos mais complexos em comparação à obtenção extracelular.

• Em alguns fungos ou em sistemas otimizados, pode ser extracelular, o que facilita a extração.

Processo de extração e purificação da enzima

O processo varia conforme a localização da enzima (intracelular ou extracelular):

• Enzima intracelular:

Etapas principais:

• Lise celular (ruptura das células para liberar a enzima), utilizando métodos mecânicos (homogeneização) ou químicos (detergentes, enzimas).

• Remoção de detritos celulares por centrifugação.

• Purificação subsequente, como cromatografia de afinidade ou troca iônica, para isolar a lactase.

• Enzima extracelular:

Etapas principais:

• Recuperação da enzima diretamente do meio de cultura por métodos como filtração ou precipitação.

• Purificação, que pode ser mais simples, pois o material inicial está menos contaminado com proteínas intracelulares.

Em questão de vantagens, comparando a extração da enzima por meio intra ou extracelular, a produção extracelular é claramente mais vantajosa, pois reduz custos ao evitar a etapa de lise celular, do mesmo modo que simplifica a purificação. Isso torna o processo mais rápido e eficiente, melhorando o rendimento e diminuindo o consumo de reagentes e energia. A produção extracelular também facilita a escalabilidade do processo, sendo ideal para aplicações industriais em larga escala.

Impacto no custo

A forma como a enzima é produzida e purificada reflete diretamente no custo:

• A produção extracelular da enzima lactase é mais barata devido ao menor número de etapas de extração.

• Uso de microrganismos geneticamente modificados pode reduzir custos de produção em larga escala, apesar de exigir maior investimento inicial em pesquisa e desenvolvimento na indústria.

• Processos mais complexos, como a lise celular e purificação intensiva, aumentam o custo de produção da enzima.

Portanto, estratégias que priorizem a produção extracelular e o uso de sistemas microbianos eficientes são fundamentais para manter a produção economicamente viável. Além disso, o desenvolvimento de linhagens microbianas otimizadas, por meio de engenharia genética, pode aumentar a taxa de secreção da enzima no meio de cultivo, reduzindo ainda mais os custos operacionais. Tecnologias como fermentação em estado líquido (submersa) com condições controladas de pH, temperatura e nutrientes também podem potencializar o rendimento. A escolha de métodos de purificação de baixo custo, como precipitação seletiva e filtração, aliada a um planejamento eficiente do processo, garante maior competitividade na indústria e viabiliza o fornecimento de lactase para diferentes setores, como o alimentício e o farmacêutico.

A reação catalisada pela lactase é a hidrólise da lactose, dissacarídeo, em glicose e galactose, monossacarídeos. Em um primeiro momento, a lactose se liga ao sítio ativo da lactase, já que este possui uma conformação complementar à lactose, facilitando o encaixe e estabilização do substrato.

A etapa catalisada é a clivagem da ligação β-1,4-glicosídica entre a glicose e a galactose, e para isso acontecer de maneira efetiva o mecanismo depende de aminoácidos catalíticos no sítio ativo que ajudam a polarizar a ligação, para facilitar a quebra dessa ligação, um resíduo de ácido-base na enzima é feito ou aceita prótons.

Durante a ocorrência, a enzima estabilizou o estado de transição, que é altamente energético, fazendo com que reduza a energia de ativação necessária.

Ao final da hidrólise, a glicose e a galactose, produtos da reação, são liberadas do sítio ativo e a enzima retorna à sua conformação original pronta para repetir novamente o processo. 

2. Há outros aspectos da catálise relevantes? 

• Especificidade do substrato: A enzima lactase é altamente específica para a lactose, devido à complementaridade entre seu substrato e o sítio ativo, por isso, depende de reconhecimento molecular, onde somente moléculas com a estrutura complementar se encaixam no sítio ativo da enzima, e interações não covalentes que ajudam a estabilizar a lactose no sítio de ligação. 

• Efeitos de microambiente: Para alterações do pH local, os aminoácidos presentes no sítio de ligação podem atuar como doadores ou aceitadores de prótons, ajustando o pH de forma muito localizada, além disso, certos resíduos no sítio de ligação ajudam a enfraquecer a ligação da lactose que será quebrada.

• Indução conformacional: Quando a lactose liga-se à lactase, ocorre uma mudança conformacional na enzima, aumentando a sua espessura no estado de transição e ainda, posiciona grupos catalíticos da enzima para reagir eficientemente com o substrato.

• Influenciadores externos: A atividade enzimática pode ser modulada por - pH, temperatura e presença de inibidores ou cofatores.

3. Quais os parâmetros cinéticos envolvidos no processo catalítico desta enzima? 

Alguns dos parâmetros cinéticos  que influenciam no processo de catálise enzimática da lactase, temos a constante de Michaelis-Menten (Km), essa constante se diz respeito a afinidade da enzima pela lactose, ou seja um alto valor da constante se diz respeito a uma alta atração entre a enzima e o nosso substrato que no caso é a lactose. Por outro lado, o valor baixo de Km nos reflete a uma baixa afinidade de conversão.

Outro parâmetro cinético relevante é a velocidade máxima, a Vmax​ representa a velocidade máxima com que a lactase converte lactose em glicose e galactose quando todas as moléculas de enzima estão saturadas com substrato. Da mesma forma seguindo o modelo de Michaelis menten, o nível de concentração do substrato também é importante para o processo catalítico tendo em vista que quanto maior a concentração de substrato disponível para a enzima, maior será o seu potencial de conversão, isso até ao nível de saturação, onde todos os sítios ativos da enzima estão saturados não convertendo mais o substrato em produto.

4. E de que forma estes mecanismos e parâmetros cinéticos interferem no processo na escala em que vocês estão propondo? 

Tendo em vista que esses valores do modelo de Michaelis-Menten tratam de dados do modelo cinético de enzima, é possível se estabelecer modelagem matemática dos bioprocessos envolvendo a enzima lactase. A modelagem matemática, utilizando parâmetros cinéticos enzimáticos é importante do ponto de vista de otimização de parâmetros, tendo em vista que enzimas são sistemas biológicos e que demandam de controle de processo, como temperatura, pH entre outros. Sendo assim com modelagem matemática, é possível desenvolver malhas de controle desses parâmetros, e também é possível otimizar condições ótimas de processo além de prever quantidade de produção de um produto, consumo de substrato, utilização em diferentes biorreatores e tantas outras variáveis que englobam os processos enzimáticos.

Dentro da cadeia produtiva de produtos a base de leite que sejam zero lactose, a etapa da imobilização da enzima lactase é uma técnica relevante para a produção e melhoria da eficiência de todo o processo. Para otimizar a atividade da lactase e reduzir os custos dentro da produção de alimentos, técnicas de imobilização como a encapsulação em matrizes poliméricas e adsorção em suportes sólidos, vêm sendo estudadas para a aplicação. 

As vantagens trazidas pela imobilização enzimática da lactase estão presentes tanto na redução de custos de produção, uma vez que pode ser feita a reutilização da enzima e reduzir as perdas ao longo do processo, além de facilitar o controle das condições de temperatura e pH, quanto na estabilização aumentada da enzima, uma vez que com a imobilização, a lactase apresenta maior estabilidade térmica e química. Com as técnicas de imobilização, ao longo da cadeia produtiva láctea há uma contribuição para a sustentabilidade e viabilidade econômica da referida indústria. 

1. Técnicas que podem ser utilizadas

   1. Encapsulação: A lactase pode ser encapsulada em matrizes poliméricas, como alginato e quitosana, pois fazem sua proteção e permitem a liberação controlada.

   2. Adsorção: Adsorvida em suportes sólidos, como sílica ou carvão ativado, onde a enzima se liga fisicamente e mantém a atividade catalítica.

   3. Imobilização Covalente: A lactase é ligada covalentemente a um suporte, garantindo uma ligação forte e estável, aumentando a durabilidade da enzima.

   4. Entrapment: Lactase é aprisionada dentro de uma rede polimérica, e permite  a passagem de substratos enquanto mantém a enzima em um espaço confinado. 

2. Modificação da enzima

A alteração da enzima lactase torna-se viável sim, tendo em vista que pode melhorar a eficiência e estabilidade da enzima. Os métodos que são utilizados visam a melhoria da atividade da lactase, e permitem uma hidrólise mais eficaz da enzima em produtos lácteos. As enzimas modificadas podem ter uma taxa de ocorrência mais alta, fazendo com que haja um aumento da sua eficiência na conversão de lactose em açúcares de menor complexidade (glicose e galactose), além de possibilitar um aumento da qualidade do produto final, quando pensamos em sabor e textura, para que as expectativas dos consumidores sejam atendidas. 

1. Técnicas que podem ser utilizadas

   1. Imobilização

   2. Mutação dirigida: Alterações específicas na sequência de aminoácidos da lactase podem ser feitas para aumentar sua atividade ou a sua resistência a condições adversas (temperatura e pH).

   3. Engenharia de proteínas: técnicas de biotecnologia para o desenvolvimento de variantes da lactase com propriedades otimizadas - maior eficiência na quebra da lactose. 

Por sem uma condição relativamente comum, a intolerância à lactose, a demanda por produtos lácteos sem lactose está em ascensão. Modificar a lactase para atender esse nicho de mercado é uma estratégia que torna viável a sua modificação. Além de que, a produção de enzimas mais eficientes contribui para práticas mais sustentáveis, economiza o desperdício e melhora a utilização de recursos.