Kloon van Moodle Lab W4: Detectie van 35S promotor in plasmide deel 2: PCR by https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q Periode 3 vaardigheden en-us 2023-03-13 15:54:38 UTC 2023-03-14 19:30:43 UTC hello@padlet.com https://padlet.net/icons/png/1f9ec.png 5 Principe / kennis over technieken 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667404 Wat is het principe? Waarom werkt deze techniek?

  • Wat doet PCR? 
  • Welke fases zijn er en wat gebeurt er dan in het monster?
  • Waarom kan je met PCR aantonen of het plasmide wel of niet 35S bevat?
...
]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667404 3 Doel 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667405 Wat is het doel van het experiment?

Het doel van dit experiment is het aantonen van de 35S promotor op een plasmide uit een bacterie dmv PCR. 

...

]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667405 4 Verwachting 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667406 Noteer hier de onderbouwde verwachting van het experiment
Het kan handig zijn verwachtingen van controles pas te noteren wanneer je de controles bedacht hebt..

Onderbouw je verwachting met prinscreen-plaatjes van de BLAST resultaten (in silico-versie van het experiment). Omdat de 35S promoter uit het cauliflower mosaic virus afkomstig is kan het handig zijn dit als organisme in te stellen blij BLAST.

...
...
...



]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667406 2 Voorschriften 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667408 Noteer hier de benodigde voorschriften

In de opdracht tekst wordt vaak gehint naar de voorschriften. Kijk naar de opdrachttekst en kijk naar de index van de voorschriften. Als je dezelfde woorden tegenkomt zijn dat vast de benodigde voorschriften. 

Deze week ga je een PCR uitvoeren, het product daarvan op agarosegel analyseren en het resultaat digitaal voorspellen:

  • K (primer BLAST; verwachting opstellen voor een PCR experiment)
  • L (PCR (Polymerase Chain Reaction))
  • A2 (agarosegelelektroforese)


]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667408 6 Materialen 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667411 Noteer hier een tabel met de benodigde materialen

Zoek in de voorschriften en de opdracht op welke materialen nodig zijn, maak een tabel waarin je op het lab ook de fabrikant kan noteren

Noteer goed:
  • Welk DNA heb je geïsoleerd / ga je gebruiken?
  • Wat voor DNA is beschikbaar voor controles?
  • Welke primers ga je gebruiken?

Materiaal, concentratie, bewaarinstructie, fabrikant
template dna
-analysemonster dna
-controle dna (+): 35s DNA (17ng/ul)
-controle dna (-): DNA dat geen 35s promotor bevat
primers
-primer F
-primer R
-precieze primers
taq buffer
taq polymerase
dNTPs
PCR-epjes
PCR-apparaat
ijshoed met ijs

TAE (10x)
sybrsafe
filtreerpapier
agarose
loading dye (6x)
DNA ladder
DNA monsters
lichtbak
demiwater
]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667411 13 Inzetschema gel 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667412 Noteer hier het inzetschema voor de agarosegel

Het is vaak handig om van tevoren te plannen hoe je de agarosegel gaat indelen. Welk monster gaat in welk slotje? Noteer dat hier.

1: 
2: 
3: 
4: 
5: 
6: 
7: 
8: 
9: 
10: 
11: 
12: 
13: 
14: 
15: ]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667412 Eventuele extra info 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667413 Je gaat deze week verder met DNA dat je in week 2 geïsoleerd hebt.

Werk samen voor de voorbereiding, anders is het misschien te veel.]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667413 1 Opdracht 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667415 Detectie van 35S promotor in plasmide

Eerder ben je begonnen met het aantonen van de 35S promotor op een plasmide door plasmides te isoleren uit bacteriën. Deze week ga je in het plasmide aan- of afwezigheid van de 35S promoter aan te tonen door middel van een polymerase chain reaction (PCR), dit mag (maar hoeft niet) in duplo. Je voorspelt je resultaat digitaal in BLAST om je verwachting te onderbouwen. Analyseer het resultaat op agarosegel.

De genetische sequentie die aantoont 35S aanwezig is, is de 35S promoter, die is afkomstig van cauliflower mosaic virus (CMV). BLAST zal dus veel CMV 'hits' geven. De NVWA (Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit) gebruikt 35S PCR ook om aanwezigheid van genetisch gemodificeerde gewassen met 35S promoter in voedingsmiddelen aan te tonen, zoals bijvoorbeeld genetisch gemodificeerde mais in doritos. Vergeet niet het experiment in silico uit te voeren zodat je de resultaten goed kan interpreteren.
 
 Op het lab is aanwezig: het pBINplusCas935S plasmide DNA dat je zelf hebt geïsoleerd uit bacteriën, 35s controle plasmide, controle DNA dat geen 35S bevat, 35S primers en alle materialen voor PCR.

Tips voor uitvoering:

  • De gebruikte GGO-promoter is afkomstig van cauliflower mosaic virus (CMV)
  • GGO-mais primers herkennen CMV-DNA, dit is het GGO-stukje in de gebruikte plasmide
  • Analyse van het PCR-resultaat: je gaat kleine fragmenten analyseren. Hiervoor is het beter om een hoger percentage agarose te gebruiken. Maak een 1.5% agarosegel en run 15 minuten op 50 V en de rest van de tijd op 75 V.
  • Bij PCR gebruik je een mastermix. Dit lijkt erg op de reactiemix voor restrictie. Het is een oplossing waarin al je materialen aanwezig zijn behalve het te gebruiken DNA.
  • De optimale Tm voor de 35S primers is 56.5 oC. Dit is lager dan je zou verwachten als je het zelf berekent, maar het werkt het beste, dus stel deze temperatuur in voor de hybridisatie-stap.



]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667415 7 Veiligheidsmap 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667416 Vul de veiligheidsmap aan met informatie over chemicalien die er nog niet in staan]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667416 8 Keuze monsters 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667417 Bij elk experiment heb je analysemonsters en zijn er controles nodig om te weten of de data van het analysemonster betrouwbaar is. Beschrijf hier welke monsters je wilt maken. 
Beschrijf per controle:
  • wat je controleert
  • Welk DNA wel of niet in het monster moet
  • Welke primers er wel of niet in het monster moeten
  • Hoe de uitkomst er uit ziet wanneer het experiment goed verloopt
    • wel / geen bandje
controle             dna                        primer            wat
analysem: onbekend dna:         35s F en R:           bevat DNA 35s promotor?
- contr 1: dna zonder promotor: 35s f en r   is matermix vervuild?
- contr 2:     geen dna:               35s F en R:      kunnen de primers niet altijd binden?
+ contr:        35s dna:                  geen primer        kan mastermix product geven:
]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667417 15 Planning 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667421
  • Bedenk dat het PCR-programma veel cycli heeft, bereken hoe lang het duurt voordat het hele programma afgerond is. Reken daar nog 20% tijd bij omdat het apparaat tussen elke stap moet opwarmen of afkoelen
  • Bedenk dat runnen van gel elektroforese ook tijd kost, langer dan de vorige weken wanneer je een hoger % agarosegel gebruikt. Beschrijf welke kleur uit de loading dye hoe ver gerund moet zijn wanneer je de gel wilt stoppen
    • Stappen die in je planning kunnen staan zijn bijvoorbeeld:
    • Materialen verzamelen
    • Gelplek inrichten
    • Epjes beschrijven
    • agarosegel oplossing maken
    • agarosegel gieten
    • agarosegel laten stollen
    • PCR runnen (... tijd)
    • Loading dye toevoegen aan DNA monsters
    • DNA monsters in de gel doen
    • Gel runnen (stroom erop zetten)
    • Resultaten bekijken op safe imager (blauwe lichtbak) en fotograferen
    • Opruimen











    ]]>     2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667421     Overzicht experiment 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667422 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667422 Labjournaal opzet 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667424 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667424 10 Pipetteerschema mastermix 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667425 Noteer hier pipetteerschema's voor de mastermix

    In het voorbeeldpipetteerschema is DNA grijs doorgestreept. Dit wordt wel genoteerd omdat je de hoeveelheid ul DNA nodig hebt om het aantal ul demiwater te berekenen, maar bij het bereiden van de mastermix voeg je het DNA nog niet toe.

    Inhoud                     1 reactie (ul)         _6_ reacties (ul)
    template DNA
    demiwater
    PCR buffer
    BSA
    dNTPs
    primer F
    primer R
    taq polymerase

    ]]>     2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667425     12 Pipetteerschema loading dye 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667426 Noteer hier het pipetteerschema voorhet toevoegen van loading dye aan de DNA monsters voor je ze op gel zet

    Loading dye heeft een concentratie van 6x. Je wilt een eindconcentratie van 1x en een eindvolume van 12 ul.

    loading dye 2 ul
    DNA 10ul
    eindvolume 12 ul ]]>     2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667426     11 Pipetteerschema monsters bereiden uit mastermix 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667427 Noteer hier hoe je het DNA verdunt voor het experiment en hoe je individuele monsters bereidt uit de mastermix

    De precieze concentratie van gekocht DNA weet je niet. Noteer dus echt de berekening in het labjournaal zodat je het op het lab kan overdoen met de concentratie die op het epje staat.

    In de voorbeeldberekening is uitgegaan van een DNA concentratie van 34 ng/ul.

    De concentratie humaan DNA is waarschijnlijk ongeveer 100-200 ng/ul. Het kan dus dat je het nog moet verdunnen voor je het kan gebruiken.

    ul mastermix             ul DNA
    ...                                   ...

    Berekening: ...

    ]]>     2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667427     9 Pipetteerschema agarosegel 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667428 Vul hier het pipetteerschema voor een 1,5% agarosegel in

    Bedenk eerst de concentratie en het eindvolume

                                            
    Agarose                            0,75   g (0,015 * 50= 0,75 g)
    TAE                                    50   ml (aanvullen tot 50 ml)
    eindvolume                       50   ml

    ul DNA dye toevoegen 10 ul DNA en 2 ul dye]]>     2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667428     14 Apparaatinstellingen 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667429 Noteer hier instellingen voor te gebruiken apparatuur

    PCR: noteer het programma

    Agarose gelelectroforese: noteer het voltage dat je wilt gebruiken, hoelang je schat dat het duurt en hoe ver de loading dye gerund moet zijn voor je stopt (is de gele, paarse of blauwe band onderaan de gel)

    Tip: een 1,5% gel runt langzamer dan een 0,7% gel. Hoe hoger het voltage, hoe sneller de gel runt, maar ook hoe slechter de bandjes gescheiden worden.


    PCR programma: 
    ....................................................................


    Agarose gel instellingen: 
    15min op 50V en 45min op 75V(of langer als nodig)]]>     2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667429     Vragen 6990341 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667430 ..]]> 2023-03-13 15:54:38 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2514667430 voorspelling op BLAST met 35S primers 7069062 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2515910892 2023-03-14 11:03:05 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2515910892 50bp ladder jgeluk1710 https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2516071919 2023-03-14 13:05:31 UTC https://padlet.com/6990341/3bokz0cv0oxixv6q/wish/2516071919