Técnica utilizada para quantificar a expressão de genes ou detectar infecções virais e bacterianas em tempo real.

Possibilita a detecção e quantificação de ácidos nucleicos (DNA) em amostras.

Permite monitorar a amplificação do DNA durante cada ciclo da reação.

Desnaturação: A dupla fita de DNA se separa em fitas simples.

Corante fluorescente que se liga ao DNA de fita dupla.

Quando o corante está ligado ao DNA, ele emite fluorescência, que pode ser detectada pelo equipamento de qPCR.

A intensidade de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de DNA amplificado.

Permite quantificar o DNA original na amostra.

Aumentam a especificidade da quantificação, pois se ligam a uma sequência alvo específica.

Reduz a possibilidade de detecção inespecífica.

Emitem fluorescência somente quando degradadas pela ação da polimerase.

Fluoróforo na extremidade 5’: Emite fluorescência.

Quencher na extremidade 3’: Supressor.

Enquanto o fluoróforo e o quencher estão próximos, a fluorescência é suprimida, evitando qualquer sinal antes da reação.

Durante o processo de amplificação, a sonda se hibridiza (liga) a uma região específica da sequência alvo entre os primers, onde o DNA será amplificado.

Essa ligação ocorre antes da extensão pelo DNA polimerase.

Quando a polimerase atinge a sonda ligada ao DNA alvo durante a etapa de extensão, ela degrada a sonda, rompendo o fluoróforo e o quencher.

Com a degradação da sonda, o fluoróforo é liberado e se separa do quencher, emitindo um sinal de fluorescência.

A intensidade da fluorescência é proporcional à quantidade de DNA amplificado.

Proporcional ao número de cópias do DNA alvo presente na amostra.

KUYPERS, J.; JEROME, K. R. Applications of Digital PCR for Clinical Microbiology. Journal of Clinical Microbiology, v. 55, n. 6, p. 1621–1628, 15 mar. 2017.

PubMed: PCR in diagnostics

SIGMA ALDRICH. Gold Nanoparticles: Properties and Applications. Merck, v. 1, n. 1, 2024.

WERNIKE, K. et al. Pitfalls in SARS‐CoV‐2 PCR diagnostics. Transboundary and Emerging Diseases, 5 jul. 2020.

Detecção de mutações genéticas.

Identificação de patógenos (bactérias, vírus ou protozoários).

Estudos de expressão gênica.

Farmacogenética e diagnóstico molecular.

Isolamento de DNA: O DNA é isolado a partir de células de sangue ou saliva.

qPCR com Sondas de Alelo Específico: Utilizam-se sondas projetadas para diferenciar alelos normais e mutantes. Apenas a sonda correspondente ao alelo presente emite fluorescência.

A presença de uma mutação é indicada pela fluorescência, e sua quantidade permite verificar a frequência do alelo mutado.

Extração de RNA: o RNA viral é extraído da amostra do paciente.

Transcrição Reversa: o RNA é convertido em DNA complementar (cDNA) pela enzima transcriptase reversa.

qPCR: a quantidade de cDNA é amplificada e quantificada por meio de sondas que emitem fluorescência ao se ligar a sequências alvo do SARS-CoV-2.