atgaccaacttcacaatcctcctcatctctcttctcttctccatcgcccacacttgcagcccctgcaaatggcagcagca gcaagatagctgccgcaagcagctccacggggtcaacctcacgccctgcgagaagcacatcatggagaagatccaaggcc gcggcgatcacgatgatgatgatgaccacgacaatcacattctcaggaccatgcggggaagaatcaactacataaggagg aacgaaggaaaagaggaagacgaagaagaagaaggacacatgcagaagtggtgcacagaaatgagcgagctgagaagccc caaatgccagtgcaaagcgctgcagaagataatgaagaaccagagcgaggaactggaggagaagcagaagaagaaaatgg agaaggagctcattaacttggctactatgtgcaggtttggacccatgatccagtgcgacttgtcctccgatgact

: vevtor에 후보유전자 X gene을 Smal 유전자 사이에 끼워넣고 이 plasmid를 E. coli에 transformation 하여 X peptide를 대량으로 생산하였다.

: 앞의 실험을 통해 E. coli에서 X peptide를 대량으로 생산한 뒤, 이를 Ni-NTA (Nitrilotriacetic acid) 크로마토그래피를 이용하여 X 단백질만을 분리했다.

(Ni-NTA 크로마토그래피는 세균, 곤충 및 포유동물 세포에서 발현되는 6xHis-tag 재조합 단백질의 정제를 위해 사용된다.)

: X-GFP fusion 단백질을 만들도록 plasmid를 만든 후 이를 식물에 직접 넣어 식물에서 X 단백질이 발현되도록 만들었다.

이때 사용한 plasmid는 앞의 실험에서 E. coli에 넣어준 것과는 다른 plasmid이며 이는 식물의 형질전환이므로 Ti plasmid를 사용했을 것으로 예상된다.

: sepharose에 Anti-GFP 항체를 붙인 resin을 사용하여 chromatography를 진행한다. 이를 통해 앞의 실험에서 GFP를 fusion시킨 X 단백질만을 정제할 수 있다.

(nicotiana benthamiana)

• plasmid vector : 발현 유전자, promoter, RBS(리보솜 결합 부위), selection marker

• host : Rosetta, C41, C43과 같은 변형 E. coli

→ 선행 연구와 동일한 방식으로 이를 증명할 예정

→ S대학교와 K한방연구소 합동

-> SS바이오에서 진행

1. 생산 속도와 비용

E. coli system이 모두 우수함

• 식물 system은 초기 유전자 변형 및 발현 시스템 구축 비용 발생

• E. coli system은 수일 내 결과 확인 가능하지만,

  식물은 수 주에서 수 개월 단위의 시간을 필요로 함

3. 안전성

의약품, 치료용 단백질과 백신 등에 식물 system을 널리 사용함

• 식물 system은 병원성 세균이나 바이러스 등을 활용하지 않음

• E. coli system은 E. coli가 생성하는 endotoxin의 제거가 필요함

*endotoxin: 의약용 단백질은 허용 농도가 5 EU/kg 체중 (EU: Endotoxin Unit) 이하로 매우 엄격함

2. post-translation 수정 가능성

단백질 내 당화나 이황화 결합이 필요한 경우 식물 system을 이용하는 것이 적합함

• E. coli system은 단백질 folding이 적절히 되지 않을 수 있음

• E. coli system은 당화와 같은 post-translation의 수정이 어려움

• 식물 system은 post-translation의 활발한 수정이 가능함

소프트웨어를 통해 당화 가능성을 미리 예측할 것임

먼저 X gene sequence와 NCBI ORF finder를 사용해

아미노산 서열을 구함

4개의 ORF가 모두 존재한다는 의미는 아니며,

가장 긴 서열인 ORF1이 해당 단백질을 암호화할 가능성 높음

→ BLAST로 앞서 구한 아미노산 서열의 신뢰성을 확인함

짧은 서열(50~200bp)은 Max Score ≥ 50 (230은 매우 높은 값)

긴 서열(200bp 이상)은 Max Score ≥ 200 이상

2. Quary cover 100%

입력 서열과 데이터베이스의 subject 서열이 전 구간 일치함

3. E-value 낮을수록 유사함

2e-77은 거의 "0"에 가까운 값임

입력 서열이 Subject 서열이 우연히 일치할 가능성은 사실상 없다고 간주할 수 있음

4. Identity = 93.04%

90% 이상이면 실제 단백질이나 유전자 기능이 비슷할 것으로 간주함

N-당화 가능성이 매우 높아 빨간색으로 표시됨

일반적으로 Serine(Ser) 또는 Threonine(Thr)

자리에 o-당화 가능성이 높음

→ Ser,Thr 자리에 #positive 표시

X peptide의 pilot-scale 유용정제법을 확립할 수 있다.

-> SS 바이오에서 진행

2S seed storage albumin protein

*BLAST 결과 100% 일치하는 subject 서열의 accession number를 이용해 추정함

• 대량 생산에 가장 특화된 Nicotiana benthamiana

• 니코틴 등의 독성 물질 제거 기술 많이 발전

• 바이러스 감염은 엄격한 생장 환경을 통해 방지

• X protein을 과발현 시킨 N. benthamiana를 보유 중

• 형질전환이 용이하고 배양하기 쉬움

• 성장속도가 빠름

• 외래 유전자를 일시적으로 발현

• agrofiltration 통해 소규모 혹은 대규모로 일시적인 단백질 발현

• 제품 개발에 필요한 시간을 획기적으로 단축하는 기술

• 장기간 생산에 부적합

Transgenic :

• 외래 유전자를 식물 유전체에 통합하여 안정적으로 발현

• 한 번 유전자 삽입이 성공하면 지속적으로 생산 가능

• 농업적 규모의 대규모 생산 시스템과 호환

=> Transgenic N. benthamiana로 선정

재배 환경: biofarm

대규모 온실 시스템

온도, 습도, 빛의 강도 등을 엄격히 조절하여 안정적인 생장과 단백질 생산을 지원

수직 농장

공간 효율성을 극대화, LED 조명을 사용해 특정 파장의 빛을 제공하여 식물의 광합성과 단백질 발현을 촉진

단백질 수확량 증가

호르몬 처리

6-benzylaminopurine (BAP) 같은 성장 촉진제 사용하여 axillary stem(측아 줄기)의 생장 유도

axillary stem

N. benthamiana 에서 단백질 총 수확량의 50%를 기여

단백질 발현량이 높아 수율 극대화 가능

: 특정 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 용액에서 단백질 항원을 침전시키는 기술로, 수천개의 서로 다른 단백질을 포함하는 sample에서 특정 단백질을 분리, 농축 가능하다.

이미 연구실에 선임 연구원이 발현, 정제 해놓은 X 단백질이 존재하므로 이 X를 보내주고 'BIONEER' 업체에 항체를 주문 제작할 예정

-> 이때 항체에 bead를 함께 붙여달라고 요청하여 따로 bead를 구매하지 않고 바로 사용할 예정

= antibody-bead conjugate

Advantage

- 세포 내 투과성 높음

- 생산비용 낮고 합성이 용이

Disadvantage

- 체내 안정성 낮음 : 빠르게 분해

- 작용 메커니즘 단순 : 일부 암 유형에 효과적

Advantage

- 특이성과 안정성이 높아 여러 암 유형에 효과

- 복잡한 작용 기전으로 광범위한 항암 효과

Disadvantage

- 생산 과정 복잡 비용 높음

- 대사 안정성이 상대적으로 낮음

가정 : x peptide/protein는 protein으로 작용할 경우 더 강한 항암효과를 가진다.

=> protein의 형태로 pilot-scale에서 발현 및 정제

peptide로 작용할 경우

• 생체 내 안정성이 낮음

• 흡수 효과 낮음

=> protein으로 작용할 때 더 효율적일 것이라는 가설 제시

Lunasin sequence

SKWQHQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD

ORF1 sequence

MTNFTILLISLLFSIAHTCSPCKWQQQQDSCRKQLHGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDHDDDDDHDNHILRTMRGRINYIRRNEGKEEDEEEEGHMQKWCTEMSELRSPKCQCKALQKIMKNQSEELEEKQKKKMEKELINLATMCRFGPMIQCDLSSDD

• 표적 항암 치료제

• 안정성 낮음

protein

• 광범위한 항암 치료제

• 안정성 높음

humidity : 50-60%

temperature : 22-23 degree centigrade

X peptide의 pilot-scale 유용정제법을 확립할 수 있다.

-> single protein을 정제하기 위함이므로 일반 IP를 사용

2. Pre-clearing the lysates

​

3. Add antibody + protein beads

​

4. Centrifuge

​

5. wash and Elute

​

6. Purify

• 형질전환한 Nicotiana benthamiana sample

• 핀셋

• 액체질소

• 막자사발

• tube

• pipette

• RIPA lysis buffer

정제한 단백질은 vial에 나누어 담아 액상 또는 동결 건조형으로 안정한 상태로 보관할 예정

+ 자동 이물검사 시스템과 제한 접근시스템을 통해 품질 관리

-> 추가적으로 이를 활용하여 정제한 단백질을 이용한 항암제 개발까지 이어질 수 있을 것으로예상하며 이렇게 만든 바이오의약품으로 추가적인 부수입을 얻을 수 있을 것으로 예상됨