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1983 – Criação da técnica por Kary Mullis.

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1983 – Criação da técnica por Kary Mullis.

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Reação em cadeia da polimerase (PCR) (artigo) | Khan Academy

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Uma técnica utilizada para amplificar, ou fazer muitas cópias de, uma região de interesse específica do DNA.

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Informações básicas e o papel da DNA polimerase.

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"Não existe teste perfeito", de acordo com a professora do Departamento de Pediatria da Faculdade de Medicina da UFMG, Glaucia Queiroz Andrade, consultora técnica do Núcleo de Ações e Pesquisa em Apoio Diagnóstico da Faculdade de Medicina (Nupad). Atualmente, para detectar a covid-19, dois tipos de exames estão disponíveis: os chamados RT-PCR e o sorológico. Mas para a maior confiabilidade dos resultados, não basta ter os testes em mãos. É preciso saber a hora certa de aplicar e em qual situação.

Os exames diagnósticos são uma das principais recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS) para controlar a disseminação do novo coronavírus, quando realizados junto ao isolamento social.

Desde o início da pandemia, o Nupad realiza o teste molecular (RT-PCR) para diagnóstico do vírus em casos suspeitos atendidos nas unidades hospitalares e ambulatoriais da rede pública. O Núcleo integra a rede de laboratórios coordenada pela UFMG, composta por 13 universidades públicas do país e dedicada a ampliar a capacidade de realização de testes diagnósticos no país.

O que é o RT-PCR?

Considerado o "padrão ouro" ou "padrão de referência", o RT-PCR é o exame que identifica o vírus e confirma a covid-19. Para isso, o teste busca detectar o RNA do vírus através da amplificação do ácido nucleico pela reação em cadeia da polimerase.
De acordo com a professora Glaucia, esse teste deve ser realizado no início da doença, especialmente na primeira semana, quando o indivíduo possui grande quantidade do vírus Sars-CoV-2.
As amostras são coletadas através de swabs (cotonetes) de nasofaringe (nariz) e orofaringe (garganta). A abordagem do exame, no momento, é do profissional de saúde que está atendendo o paciente no hospital, ambulatório ou consultório. Isso porque é preciso saber a fase da doença para a coleta da amostra.

"Se o vírus Sars-CoV-2 for pesquisado muito precocemente após o contato suspeito, o indivíduo pode estar infectado, mas ainda sem vírus detectável (resultado de RT-PCR falso-negativo). O mesmo resultado pode ser encontrado se a amostra for coletada após o desaparecimento do vírus (mais de 3 semanas de doença)", explica a professora.

Repetição de exames

O resultado falso-negativo ocorre quando o teste deveria ser positivo porque o indivíduo possui covid-19, mas é negativo. O falso-positivo, ao contrário, é quando teste deveria ser negativo porque o indivíduo não possui o vírus, mas o resultado é positivo. Glaucia comenta que, às vezes, os resultados não são definitivos, uma vez que podem não ser claros.

"Resultados falso-positivos podem levar à quarentena desnecessária e problemas para rastreamento dos contatos; enquanto resultados falso-negativos podem levar à não identificação de pessoas infectadas e disseminação da infecção", alerta a professora.

Por isso, a especialista frisa que os resultados dos testes devem ser sempre avaliados por um profissional de saúde, "que pode solicitar a repetição do exame ou a realização de outros exames".

Testes sorológicos

Enquanto o RT-PCR deve ser realizado no início da doença, os testes sorológicos são feitos a partir da segunda semana, quando a quantidade de vírus diminui progressivamente e o indivíduo produz anticorpos contra o vírus, principalmente das classes IgG e IgM.

A professora Glaucia explica que os anticorpos da classe IgM são mais precoces, e podem ser detectados a partir da 2ª semana de infecção. "Já os da classe IgG aparecem mais tardiamente, geralmente após 14 dias da infecção, e persistem por mais tempo", diferencia.

Os testes de sorologia tradicional para identificar os anticorpos são obtidos nas amostras de soro após punção venosa, realizada em laboratório. Também podem ser obtidos em testes rápidos (imunocromatográficos), realizados em sangue capilar obtido por punção digital.

Medidas de controle

No entanto, estudos sugerem que os anticorpos só são desenvolvidos após a segunda semana após o início dos sintomas. Por isso, a OMS não recomenda o uso de testes rápidos sorológicos na prática clínica. Isso porque o diagnóstico de anticorpos só será possível em uma fase de recuperação do paciente, o que pode ser tarde para uma intervenção clínica ou interromper a transmissão da doença com medidas como o isolamento.

O uso de testes sorológicos, até o momento, é mais indicado para auxiliar a identificar grupos ou populações que já tiveram contato com o vírus. Assim, o gestor de saúde pode, por exemplo, avaliar a população ou grupo de risco para adotar medidas de controle.

Teste de farmácia

Os testes rápidos podem ser comprados em farmácias. Mas a professora Glaucia Andrade pondera que em geral, devido à urgência da sua liberação para uso, eles não foram adequadamente validados e apresentam incertezas quanto à sua precisão. Por isso, não são recomendados para confirmar o diagnóstico nos casos agudos.

Assintomáticos

Para pessoas que estão sem sintomas da covid-19, o teste em farmácia não se justifica.

"Como os testes ainda têm muitas incertezas em relação à confiabilidade dos seus resultados, o risco é a pessoa ter um resultado positivo, sentir segurança, se expor à infecção, e o resultado do teste ser falso-positivo",
esclarece a professora Glaucia Andrade

De acordo com ela, pelo o que se sabe até o momento, em casos individuais, não justifica testar. "O teste deve ser recomendado após exposição, dependendo do tempo pós-exposição, e para determinados grupos de risco, de acordo com decisão médica", acrescenta.

Em relação à confiabilidade dos testes rápidos, a professora orienta a aguardar. "Os testes estão sendo validados e, em breve, teremos mais segurança nos seus resultados", diz.

Mas se uma pessoa não estiver com sintomas da covid-19 e teve contato há poucos dias com paciente sabidamente positivo, o rastreamento de contato pode ser feito por meio do teste de biologia molecular (RT-PCR).

"O rastreamento dos contatos tem por objetivo verificar se a pessoa está infectada e pode transmitir a infecção a outras pessoas, mesmo que assintomática", explica a professora Glaucia Andrade.

Confiabilidade

Para reduzir o risco de resultados de exames que não expressem a realidade do paciente, a professora afirma que três itens devem ser considerados:

1 testes com bom desempenho, isto é, que sejam sensíveis (detectem o vírus ou os anticorpos quando eles realmente estão presentes) e específicos (confirmem a ausência do vírus ou dos anticorpos quando eles realmente estão ausentes);
2 conhecer a prevalência da covid-19 no país;
3 conhecer a evolução da doença realizando o teste no momento em que as chances de um resultado positivo são maiores.

Outros fatores como a carga viral, a resposta imune do hospedeiro, o uso de medicamentos imunossupressores ou doenças imunossupressoras também podem interferir nesses resultados e levar a falso-negativos. Também é possível ter resultados falso-positivos por reação cruzada com outros coronavírus ou outras infecções, além de problemas técnicos na execução do exame.

Nota técnica

Professores do Departamento de Propedêutica da Faculdade de Medicina da UFMG (PRO) elaboraram uma nota técnica para orientar a população e os profissionais de saúde sobre quem e quando testar, as amostras biológicas adequadas para análise, o alcance e as limitações dos exames disponíveis no momento.

A nota técnica " Estratégias laboratoriais para identificação da infecção pelo novo coronavírus" está publicada no site medicina.ufmg.br/coronavirus, onde a Faculdade reúne informações sobre a covid-19 e apresenta suas ações diante da pandemia.

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RT-PCR ou sorológico? Entenda as diferenças entre os testes para a covid-19

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"Não existe teste perfeito", de acordo com a professora do Departamento de Pediatria da Faculdade de Medicina da UFMG, Glaucia Queiroz Andrade, consultora técnica do Núcleo de Ações e Pesquisa em Apoio Diagnóstico da Faculdade de Medicina (Nupad). Atualmente, para detectar a covid-19, dois tipos de exames estão disponíveis: os chamados RT-PCR e o sorológico.

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Muitos sabem o que é a PCR, afinal é (quase) um pré requisito para ser um Biomédico, hoje vou falar um pouquinho sobre a reação, como ela acontece e algumas de suas variações.

A PCR é a reação de amplificação de DNA in vitro, a técnica representa o processo de replicação de DNA em um tubo Eppendorf. A reação precisa de variações de temperatura para poder acontecer, e antes de se descobrir a Taq DNA Polimerase a reação era manual, o que devia tornar a técnica extremante exaustiva, pois a cada ciclo devia adicionar mais Polimerase para realizar a amplificação.

O ciclo de temperaturas é repetido por cerca de 30 vezes, para se garantir que a reação gere uma quantidade boa de amostra. O processo inicia-se em 96°C (desnaturação da molécula de DNA molde), depois 60°C (anelamento, ou seja, ligação do primer com a molécula de DNA molde) e por fim 72°C (extensão do DNA).

Lembrando que para que a reação aconteça é extremamente necessário que se tenha 7 "ingredientes", que seriam: 2 primers de RNA específicos para a região de interesse (que seriam os iniciadores), dNTPS (que dão origem aos nucleotídeos), Mg+ (Cofator para a Taq DNA Polimerase), agente tamponante e água. Além, claro, da Taq DNA Polimerase e o DNA amostral.

Existem diversos tipos de PCR e acredito que se eu ficar falando aqui, essa postagem vai longe, porém vou falar de algumas, que foram as que mais foram utilizadas e apresentadas no curso (para mim) até agora.

PCR-Multiplex - Utilização de vários primers de RNA e com isso consegue amplificar vários alvos simultaneamente.

PCR-RFLP - amplificação do fragmento de restrição (após utilização de enzimas de restrição)

PCR-RT (Transcriptase reversa) - Utilizada para adquirir cDNA a partir do mRNA e assim poder obter informações sobre a proteína formada, normalmente realiza a PCR convencional, para se amplificar a quantidade de cDNA obtida.

qPCR ou PCR Real Time - utilizada para QUANTIFICAÇÃO de DNA na amostra, essa quantificação acontece durante toda a reação. E para que isso aconteça é necessário que utilize-se marcadores de DNA, seja corante como o SYBR green (cora todas as moléculas de DNA em dupla fita), como por sondas sequência-específica como o TaqMan (pode utilizar mais de uma cor, com isso pode ser utilizada em Multiplex e é mais ESPECÍFICA), ambas tem a mesma função, que seria marcar o DNA.

Para garantir que os resultados sejam confiáveis, realiza-se a curva de dissociação.

E o que seria? A curva de dissociação é construída a partir da TM ( time-melting ou seja tempo de desnaturação) das moléculas de DNA, se todas tiverem o mesmo pico, significa que não houve contaminação da reação e com isso que a sua reação foi efetiva e confiável.

Importante ressaltar que a qPCR pode ser uma PCR Multiplex, porém o inverso não é verdadeiro.

A utilização da técnica é infinita, uma vez que pode ser utilizada para encontrar agente patogênicos, identificar indivíduos, utilizar em pesquisa. Use a sua criatividade que você com certeza encontrará uma utilidade para a PCR.

Saudações Biomédicas

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Muitos sabem o que é a PCR, afinal é (quase) um pré requisito para ser um Biomédico, hoje vou falar um pouquinho sobre a reação, como ela acontece e algumas de suas variações. A PCR é a reação de amplificação de DNA in vitro, a técnica representa o processo de replicação de DNA em um tubo Eppendorf.

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Reconhecida com o Prêmio Nobel de Química em 1994, a técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) proporcionou avanços na pesquisa científica, principalmente em biologia molecular. A técnica trouxe benefícios que impulsionaram o sequenciamento genético para testes de paternidade e investigações forenses, expressão gênica em sistemas recombinantes, além do diagnóstico de doenças e testes de novos medicamentos.

Existem diferentes formas da aplicação de PCR, entre elas, três se destacam:
PCR Convencional
Consiste na replicação de sequências específicas de DNA utilizando equipamentos termocicladores. Para realizar a reação acrescentam-se às amostras de material genético sequências iniciadoras complementares (também conhecidas como primers), desoxirribonucleotídeos e DNA-polimerase termo resistente.

Através da variação cíclica de temperaturas realizada pelo termociclador ocorre a desnaturação das fitas complementares de DNA, o anelamento de primers com suas regiões específicas de cada fita e a replicação do fragmento pela enzima DNA-polimerase. Após realizar um determinado número de ciclos, obtém-se milhares de cópias da sequência gênica de interesse.
RT-PCR
Na Polimerase por Transcriptase Reversa (RT-PCR) as moléculas de RNA são convertidas em DNA complementar (cDNA) através da atividade da enzima transcriptase reversa. Em seguida, os cDNAs recém-sintetizados são amplificados através dos mesmos procedimentos descritos na PCR convencional.

Uma vez que a técnica de RT-PCR permite amplificar amostras de RNA, sua aplicação é muito utilizada para detecção de doenças genéticas, patógenos virais e bacterianos.
qPCR
A técnica de PCR quantitativa (qPCR) utiliza os princípios básicos da PCR com o diferencial que permite a quantificação do material amplificado em tempo real. Termocicladores especializados são capazes de fornecer condições ideias de temperatura para a amplificação, bem como de detectar os sinais emitidos por reagentes específicos à medida que o DNA é amplificado.

A grande vantagem dessa aplicação é a rapidez na obtenção dos resultados. Além disso, é amplamente utilizada em associação à RT-PCR (qRT-PCR ou RT-qPCR), principalmente na área diagnóstica.
Para melhores resultados
Como as técnicas de PCR demandam o uso de altas temperaturas, a realização dessas reações requer atenção especial na seleção dos materiais que são utilizados. Esses cuidados devem envolver desde a seleção dos reagentes (enzimas polimerases, primers e nucleotídeos), até consumíveis plásticos utilizados como tubos, placas, tampas e selos.

O uso de materiais impróprios pode interferir liberando inibidores ou contaminantes na reação. Por isso, é sempre importante utilizar materiais confeccionados em plástico homogêneo e com paredes finas para a melhor transferência térmica, com certificação de esterilidade e livres de contaminantes como DNases, RNases e materiais genéticos.

A Greiner Bio-One entrega ao mercado materiais que possibilitam um alto padrão de qualidade para biologia molecular com materiais livres de DNase, RNase, DNA humano, não pirogênicos e não citotóxicos. Você pode conferir mais em: www.gbo.com.br, ou entre em contato: info@br.gbo.com.

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Referências:
Zaha, A.; Ferreira, H. B.; Passaglia, L. M. P - Organizadores. Biologia molecular básica. 5ª ed. Artmed, 2014.

Alberts B.; Johnson A.; Lewis J.; Raff M.; Roberts K.; Walter P. Biologia molecular da célula. 5ª ed. Artmed, 2010.

Garibyan, L.; Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR), Journal of Investigative Dermatology, 133(3): e6, 2013.

Bustin, S., Benes, V., Nolan, T., & Pfaffl, M. Quantitative real-time RT-PCR - a perspective, Journal of Molecular Endocrinology, 34(3), 597-601, 2005.

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PCR: saiba mais sobre a técnica e como melhorar seus resultados | Revista Analytica

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Reconhecida com o Prêmio Nobel de Química em 1994, a técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) proporcionou avanços na pesquisa científica, principalmente em biologia molecular. A técnica trouxe benefícios que impulsionaram o sequenciamento genético para testes de paternidade e investigações forenses, expressão gênica em sistemas recombinantes, além do diagnóstico de doenças e testes de novos medicamentos.

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Reação em cadeia da DNA-Polimerase | Biotecnologia | Biologia | Khan Academy

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Nome: Maria Eduarda Viglioni

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Unicamp estimula produção local de insumos para o principal teste de COVID-19

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Nome: Maria Eduarda Viglioni

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A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trouxe enormes benefícios e desenvolvimentos científicos como o sequenciamento de genomas, a expressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética molecular, a determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de doenças infecciosas.

A PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction, é uma metodologia que pode ser executada inteiramente in vitro sem o uso de células.

A técnica da PCR foi desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis, que recebeu, em 1994, o prêmio Nobel.

A PCR possibilita a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA-polimerase, a mesma que participa da replicação do material genético nas células.

Esta enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, desde que um pequeno fragmento (o iniciador, ou primer, em inglês) já esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese.

Os iniciadores definem a sequência a ser replicada e o resultado obtido é a amplificação de uma determinada sequência DNA com bilhões de cópias.

Aplicações

A PCR é utilizada para amplificar, detectar, quantificar sequências específicas de ácidos nucleicos.

Isso abriu enormes perspectivas para a análise de genes, diagnóstico de doenças genéticas e detecção de agentes infecciosos como vírus, bactérias, fungos etc.

Na linha das doenças genéticas, o permanente desenvolvimento de novos protocolos tem permitido a pesquisa de pequenas alterações na sequência de DNA, como, por exemplo, na fibrose cística.

Outras aplicações especialmente úteis para a PCR é a clonagem de um determinado fragmento de DNA, que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante (cDNA) obtido a partir da molécula de RNA, o que permite o estudo da expressão de genes.

Finalmente, a PCR tem um grande potencial na medicina forense. Sua sensibilidade torna possível utilizar uma amostra bastante pequena (traços mínimos de sangue e tecidos que poderiam conter os restos de somente uma única célula) e ainda se obter uma "impressão digital de DNA" da pessoa da qual a amostra foi coletada, podendo assim fazer comparações com aqueles obtidos de vítimas e/ou suspeitos de casos de infração penal.

Componentes necessários

Amostra de DNA a ser testada;

Par de iniciadores (primers): senso (forward) e antisenso (reverse);

Nucleotídeos (dNTPs);

Enzima Taq DNA polimerase;

Solução tampão, água e cloreto de magnésio.

Equipamento

O equipamento utilizado é chamado de Termociclador.

Ele possui um bloco térmico com espaços para os tubos das reações.

Ciclagem

Desnaturação

A temperatura elevada (geralmente acima de 90ºC) separa a cadeia dupla de DNA, devido ao rompimento das pontes de hidrogênio.

As ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose (ligações covalentes e mais fortes) permanecem intactas.

Anelamento

A temperatura normalmente encontra-se entre 50°C e 65°C, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência.

Os iniciadores (os primers) ligam-se às extremidades da sequência alvo, marcando onde deverá ocorrer a amplificação do DNA.

Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação.

Extensão

Após a ligação dos primers (anelamento) às sequências complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72ºC e a enzima Taq DNA polimerase inicia a replicação das novas fitas de DNA.

O processo de síntese é iniciado no local onde estão ligados os primer. A Taq polimerase incorpora os nucleotídeos complementares à sequência alvo utilizando os dNTPs que foram adicionados no preparo da reação.

Revelação

Finalizada a PCR, o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados.

Em geral, isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose (corado com brometo de etídio, ou corante similar) ou poliacrilamida (corado pelo nitrato de prata).

Referência

Minha experiência profissional.

NOVAIS, C.M; ALVES, M.P. PCR em tempo real. Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. Edição nº 33. 2004.

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biomedicina padrão: reação em cadeia da polimerase - pcr

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A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trouxe enormes benefícios e desenvolvimentos científicos como o sequenciamento de genomas, a expressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética molecular, a determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de doenças infecciosas.

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As aplicações da Reação em Cadeia da Polimerase na medicina humana

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A Reação em Cadeia da Polimerase - PCR - tem sido uma ferramenta aliada a medicina na pesquisa, diagnóstico e monitoramento de diferentes tipos de doenças. Também, é uma ferramenta utilizada para a determinação de características genéticas individuais e em análises forenses. Veja alguns exemplos a seguir.

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Consiste na replicação de sequências específicas de DNA utilizando equipamentos termocicladores. Para realizar a reação acrescentam-se às amostras de material genético sequências iniciadoras complementares (também conhecidas como primers), desoxirribonucleotídeos e DNA-polimerase termo resistente.

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Vídeo didático explicando como é realizado o procedimento de Reação em cadeia da Polimerase.

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A presente publicação explica como é realizado o procedimento, onde o material genético é recolhido na célula ou local para ser estudado, que geralmente é utilizado o DNA e ao ser extraído é adicionado ao pre-mix, onde estão presentes os dNTPs, sendo estas bases nitrogenadas que se ligam aos iniciadores e a enzima DNA polimerase em solução tampão, o material é levado ao termociclador, onde é aquecido e esfriado em ciclos de temperaturas pré-estabelecidos, no final a análise é feita pela eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida e interpretada por um profissional treinado. Hodiernamente, laboratórios de investigação médica e biológica utiliza o PCR, para a identificação de doenças hereditárias, teste de paternidade, detecção de organismos causadores de infecções e etc.

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A Reação em Cadeia da Polimerase (que em inglês é Polymerase Chain Reaction - PCR) é definida como uma técnica de amplificação de ácido desoxirribonucleico (DNA) sem utilizar organismos vivos.

Este processo foi descrito primeiramente por Kary Mullis, no ano de 1983, sendo que somente dez anos depois foi lhe concedido o Prêmio Nobel da Química pelo seu trabalho. No ano de 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou esta técnica.

Atualmente, o PCR é utilizado em laboratórios de investigação médica e biológica objetivando diferentes tarefas, como a identificação de doenças hereditárias, a construção de árvores filogenéticas, a clonagem de genes, teste de paternidade, detecção de organismos causadores de infecções, concepção de organismos transgênicos, entre outras.

Para a realização deste procedimento, o primeiro passo é extrair o material genético da célula ou do local a ser estudado com cuidado para que o mesmo não seja danificado e nem sofra contaminação. Habitualmente, o material coletado é o DNA; todavia, pode-se utilizar o RNA em uma RT-PCR que consiste em um desdobramento do PCR e apresenta outras aplicações.

Após a extração do material, juntamente a este é adicionada uma mistura, também chamada de pré-mix, na qual estão presentes os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfato), sendo estas bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os denominados primers (também conhecidos por oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Este material vai para um aparelho conhecido como termociclador, aquecendo e esfriando o material ali contido em ciclos de temperatura pré-estabelecidos.

Primeiramente, o tudo é aquecido a uma temperatura entre 90° a 96°C para que ocorra a desnaturação do DNA (separação das fitas). Por conseguinte, a temperatura do termociclador cai (50° a 60°C) para que haja a hibridização ou anelamento. Neste ponto do procedimento, os primers se ligam com especificidade às suas seqüências complementares do DNA. Subsequentemente, há uma elevação da temperatura a aproximadamente 72°C para que ocorra a síntese pela polimerase (extensão de uma nova molécula). Em seguida, um novo ciclo é iniciado, sendo que normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação, apresentado taxa de replicação exponencial.

A análise do resultado é feita por um meio da eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, sendo interpretada por um profissional treinado.

Certos problemas técnicos podem interferir no resultado do PCR, como a contaminação do material por substâncias que conhecidamente inibem a reação, como é o caso da hemoglobina, bem como a contaminação por um material genético que não está sendo estudado. Deste modo, para reduzir as chances de erro, os profissionais que manuseiam as amostras devem adotar certas medidas, como o uso de luvas, tubos descartáveis, dentre outras.

Fontes:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase
http://educacao.genesisdbm.com.br/educacao_pcr.shtml

Texto originalmente publicado em https://www.infoescola.com/genetica/reacao-em-cadeia-da-polimerase/

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Reação em Cadeia da Polimerase - Genética

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A Reação em Cadeia da Polimerase (que em inglês é Polymerase Chain Reaction - PCR) é definida como uma técnica de amplificação de ácido desoxirribonucleico (DNA) sem utilizar organismos vivos. Este processo foi descrito primeiramente por Kary Mullis, no ano de 1983, sendo que somente dez anos depois foi lhe concedido o Prêmio Nobel da Química pelo seu trabalho.

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A proteína C reativa, também conhecida pela sigla PCR, é uma proteína produzida no fígado, cuja concentração sanguínea se eleva radicalmente quando há um processo inflamatório em curso, situação que pode ser provocada por infecções, neoplasias, doenças reumáticas ou traumatismos.

Na maioria dos casos, uma PCR elevada indica que o paciente tem uma infecção bacteriana, mas qualquer tipo de processo inflamatório pode ser a causa.

A concentração sanguínea da proteína C reativa pode ser dosada através de um simples exame de sangue. Hoje em dia, qualquer laboratório faz a dosagem da proteína C reativa.

Se a PCR estiver alta, isso sugere fortemente um processo infeccioso em curso. A PCR, porém, é um exame inespecífico. Ela nos ajuda a detectar precocemente a existência de uma infecção no organismo, mas ela é incapaz de dizer a sua origem. Ou seja, ela sugere que o paciente tenha uma infecção, mas não diz qual é o tipo nem em que órgão ela se encontra.

Recentemente, descobriu-se que o valor da PCR pode ser útil também para indicar quais são os indivíduos com maior risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Pequenas, mas persistentes, elevações da PCR estão associadas a um maior risco de eventos cardiovasculares no futuro, como infarto e AVC.

Atenção: a sigla PCR também é utilizada por alguns laboratórios para uma técnica chamada "reação em cadeia da polimerase", que é utilizada para identificar germes infecciosos através do seu DNA ou RNA, como na pesquisa pelo Coronavírus. Esse exame é completamente diferente da dosagem da proteína C reativa.

O que é a proteína C reativa?

O fígado é o órgão responsável pela síntese das proteínas que circulam na corrente sanguínea. Em estados de estresse para o organismo, como nos casos de infecções ou lesões de órgãos e tecidos, o fígado aumenta a produção das chamadas proteínas de fase aguda. Essas proteínas possuem atividade anti-inflamatória e ajudam o sistema imunológico a combater germes invasores. Dentre as várias proteínas de fase aguda existentes, a proteína C reativa é uma das que mais se destaca.

A proteína C reativa foi descoberta na década de 1930 após análises do sangue de pacientes com pneumonia. Naquela época, os investigadores notaram que a PCR encontrava-se muito elevada durante a fase ativa da pneumonia , mas desaparecia do sangue quando o paciente ficava curado. Não demorou muito para que se descobrisse que esse fenômeno não ocorria somente na pneumonia, mas sim em qualquer infecção relevante no organismo, principalmente aquelas de origem bacteriana.

Mas a PCR não se limita a detectar infecções. Qualquer doença que provoque uma reação inflamatória por parte do organismo pode cursar com níveis elevados de proteína C reativa. Entre as condições não infecciosas que podem provocar elevação da PCR, podemos citar:

As doenças listadas acima são apenas alguns exemplos, a lista completa, incluindo as doenças infecciosas, tem dezenas de exemplos.

Para que serve

A proteína C reativa é muito usada para ajudar no diagnóstico de doenças inflamatórias/infecciosas e para o acompanhamento da eficácia do seu tratamento.

Como já referido, a PCR é um exame inespecífico. Ela nos diz que existe uma inflamação em curso, mas não ajuda muito na hora de identificar qual é o agente causador. Para identificar a origem da infecção são necessários outros dados, como uma correta interpretação da história clínica, dos sinais e sintomas do paciente e a utilização de outros exames complementares, como a radiografia de tórax, análises de urina, ultrassonografia, etc.

Proteína C reativa nos casos de infecção

A concentração de proteína C reativa no sangue eleva-se precocemente em casos de infecção. Apenas 2 horas após o início do quadro infeccioso, já é possível detectar um aumento do valor da PCR no sangue.

A PCR serve para ajudar no diagnóstico e para acompanhar a eficácia do tratamento, pois, conforme os antibióticos vão surtindo efeito e a infecção vai sendo vencida, o valor da proteína C reativa começa a cair. Um paciente que após 48-72 horas de tratamento com antibiótico não vê melhora no seu quadro clínico e não apresenta sinais de queda da PCR provavelmente precisará de um novo plano de tratamento, pois o atual não demonstra estar sendo eficaz.

Historicamente, nós sempre utilizamos, através do hemograma, o número de leucócitos no sangue para fazer esse papel de diagnosticar e acompanhar a evolução de uma infecção. A PCR, porém, mostrou-se ser um exame mais confiável, já que seus valores sobem e caem mais rapidamente de acordo com o estado da infecção.

Hoje em dia, é comum utilizarmos tanto o hemograma quanto a PCR como exames complementares nos casos de infecção.

Proteína C reativa nos casos de doenças reumáticas

As doenças reumáticas e as doenças autoimunes costumam provocar quadros de inflamação crônica no organismo, levando, assim, à elevação da PCR.

Ao contrário das doenças infecciosas, principalmente daquelas provocadas por bactérias, nas quais a PCR eleva-se bastante, frequentemente mais de 20 a 30 vezes o seu valor normal, a PCR nas doenças reumáticas costuma estar apenas um pouco elevada.

Nestes casos, a PCR serve como parâmetro de atividade da doença. Por exemplo, pacientes com artrite reumatoide que apresentam elevação persistente da PCR costumam ter mais lesões ósseas e mais deformidades das articulações a médio/longo prazo.

Ao contrário da maioria das doenças reumáticas e autoimunes, o lúpus eritematoso sistêmico parece ser um caso à parte, pois a atividade da doença não costuma ter relação com os valores da PCR.

Proteína C reativa nos casos de câncer

Ao contrário das infecções e das doenças reumáticas, a PCR não costuma ser utilizada na investigação dos pacientes com suspeita de câncer. Isso ocorre porque nem todos os cânceres causam elevação da PCR, e quando o fazem, o valor da elevação costuma ser baixo, difícil de ser distinguido de outras situações mais comuns.

Existem, contudo, algumas exceções nas quais o PCR pode ser útil. Uma elevação inexplicada da PCR, por exemplo, pode ser um sinal de recidiva de um tumor previamente tratado. Outro exemplo são os pacientes com mieloma múltiplo ou linfoma, uma vez que valores persistentemente elevados da PCR costumam indicar uma doença mais agressiva, sugerindo pior prognóstico, com menor tempo de sobrevida.

É bom salientar que, em geral, não se pede PCR somente com o intuito de pesquisar um câncer. Da mesma forma, um paciente com PCR inexplicavelmente elevado tem muito mais chances de ter uma doença inflatória benigna ou uma infecção do que ter um câncer oculto.

Valores normais

Os resultados da PCR podem ser descritos em mg/dL ou mg/L. Como as duas formas são frequentemente usadas pelos laboratórios, vou usar as duas unidades de medição ao longo do restante do artigo.

Em pessoas sadias, a PCR costuma estar abaixo de 0,3 mg/dL (3 mg/L), mas esse valor pode ser um pouco mais elevado em indivíduos idosos.

Valores de PCR entre 0,3 mg/dL (3 mg/L) e 1,0 mg/dL (10 mg/L) podem ocorrer em situações de inflamação mínima, como uma gengivite ou um resfriado. Pessoas obesas, diabéticas, hipertensas, portadores de insuficiência renal, consumidores regular de álcool, fumantes ou pessoas sedentárias também podem ter valores discretamente elevados de PCR.

Valores de PCR acima de 1,0 mg/dL (10 mg/L) já começam a ser mais compatíveis com infecções ou processos inflamatórios mais intensos. Valores entre 1,0 mg/dL (10 mg/L) e 4,0 mg/dL (40 mg/dl) são compatíveis com infecções virais mais fortes, tipo gripe, mononucleose, catapora, etc. Tumores e doenças reumáticas também costumam causar elevação da PCR nesta faixa.

Valores da proteína C reativa acima de 4,0 mg/dL (40 mg/L) são mais compatíveis com infecção bacteriana. Em casos de sepse, os valores facilmente ultrapassam os 20 mg/dL (200 mg/L).

Antigamente, os resultados da PCR eram divulgados apenas como positivo ou negativo. Se os valores fossem acima de 1,0 mg/dL (10 mg/L), o laboratório considerava o resultado como PCR positivo, fosse ele 1,5 mg/dL ou 30 mg/dL. Como vocês podem imaginar, esse tipo de resultado ajuda pouco. Com as técnicas mais modernas, capazes de medir exatamente os valores da PCR, esta forma de divulgar o resultado da proteína C reativa acabou sendo abandonada.

Proteína C reativa ultrassensível e as doenças cardiovasculares

Os testes habituais que medem os valores sanguíneos da PCR costumam ter um limite inferior que fica ao redor de 0,3 mg/dL (3 mg/L). Sempre que o paciente tiver um valor de proteína C reativa abaixo de 0,3 mg/dL, o laboratório fornecerá o resultado como PCR < 0,3 mg/dL (< 3,0 mg/L).

Recentemente, novas técnicas de detecção da proteína C reativa têm permitido uma avaliação mais detalhada dos resultados dos pacientes com PCR abaixo de 0,3 mg/dL. Um exame chamado proteína C reativa altamente sensível (PCR-as) ou proteína C reativa ultrassensível (PCR-us) permite detectar com segurança valores de PCR tão baixos quanto 0,03 mg/dL (0,3 mg/L).

Essa possibilidade de detectar valores muito baixos possibilitou o uso da PCR-us como um preditor de doenças cardiovasculares. Vamos a uma rápida explicação para vocês entenderem melhor.

Evidências acumuladas desde a década de 1990 vêm apontando para um papel central da inflamação na origem da aterosclerose e, por consequência, no aparecimento de doenças cardiovasculares, como o infarto do miocárdio. Mais de 30 estudos já demonstraram que uma inflamação silenciosa de pequena intensidade, caracterizada por elevações bem pequenas, mas persistentes, da proteína C reativa, está claramente relacionada a um maior risco de desenvolvimento de placas de colesterol nos vasos sanguíneos, o que facilita o surgimento de doenças cardiovasculares (leia: Infarto do miocárdio - Causas e Prevenção).

Nos indivíduos sadios, o valor normal da PCR dosada pelo método de PCR-as é menor que 0,1 mg/dL (1 mg/L). Em média, pessoas sem doenças possuem uma PCR ao redor de 0,07 e 0,08 mg/dL (0,7 e 0,8 mg/L).

Os diversos estudos realizados ao longo das últimas 2 décadas têm mostrado que os indivíduos que apresentam uma PCR persistentemente acima de 0,1 mg/dL (1 mg/L), apresentam um estado crônico de inflamação mínima, o que aumenta, a longo prazo, o risco de doenças cardiovasculares.

Portanto, de forma resumida, o que os estudos têm apontado é o seguinte:

Pessoas com PCR persistentemente abaixo de 0,1 mg/dL (1 mg/L) possuem baixo risco de desenvolver doenças cardiovasculares.

Pessoas com PCR persistentemente entre de 0,1 mg/dL (1 mg/L) e 0,3 mg/dL (3 mg/L) possuem um risco moderado de desenvolver doenças cardiovasculares.

Pessoas com PCR persistentemente acima de 0,3 mg/dL (3 mg/L) possuem um risco elevado de desenvolver doenças cardiovasculares.

Obviamente, os resultados da PCR não podem ser interpretados durante um quadro de infecção. Esses valores devem ser pesquisados enquanto o paciente encontra-se sem nenhuma queixa clínica.

Como já foi referido, indivíduos diabéticos, hipertensos, fumantes e/ou obesos apresentam frequentemente níveis de PCR acima de 0,3 mg/dL (3 mg/L). Não é surpresa, portanto, que essas doenças já tenham sido há vários anos identificadas como importantes fatores de risco para problemas cardiovasculares.

Referências

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PROTEÍNA C REATIVA - Exame de sangue PCR * MD.Saúde

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A proteína C reativa, também conhecida pela sigla PCR, é uma proteína produzida no fígado, cuja concentração sanguínea se eleva radicalmente quando há um processo inflamatório em curso, situação que pode ser provocada por infecções, neoplasias, doenças reumáticas ou traumatismos.