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A reação em cadeia da polimerase específica para metilação (MSP-PCR) é uma das técnicas mais amplamente utilizadas;

Importante na análise dos perfis de metilação do DNA, principalmente em regiões promotoras de genes;

A MSP facilitou a detecção da hipermetilação do promotor em ilhas CpG em linhagens celulares e amostras clínicas;

A metilação de DNA é um mecanismo epigenético crucial na regulação da expressão gênica.

A metilação aberrante está frequentemente associada a processos patológicos, como o câncer;

A capacidade da MSP de diferenciar citosina metilada de não metilada depende:

Do tratamento do DNA com bissulfito de sódio, que retém as marcas de metilação das citosinas + amplificação específica desse DNA modificado usando conjuntos de primers complementares apenas aos alelos anteriormente metilados ou não metilados.

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Diagnóstico para determinar o estágio da doença;

Resposta ao tratamento e avaliação do risco de recorrência;

Monitorar a eficácia de tratamentos epigenéticos, como terapias com agentes desmetilantes, projetadas para reverter a metilação anormal do DNA.

Identificação de marcadores epigenéticos para doenças neurodegenerativas e autoimunes.

Estudos sobre silenciamento de genes e regulação epigenética.

Potencial para triagem de doenças e abordagens de tratamento personalizadas.

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1. Tratamento com bissulfito de sódio

• O DNA genômico é tratado com bissulfito de sódio, que converte citosinas não metiladas em uracil.

• As citosinas metiladas permanecem inalteradas.

2. Design de primers específicos

• São desenhados dois pares de primers:

• Primers para DNA metilado (M);

• Primers para DNA não metilado (U);

3. Amplificação por PCR

• O DNA tratado é amplificado em duas reações separadas, usando os primers específicos para DNA metilado e não metilado.

• O produto amplificado é analisado por eletroforese em gel de agarose ou por técnicas quantitativas, como PCR em tempo real.

4. Análise de Resultados

• A presença ou ausência de produtos amplificados indica se a região alvo está metilada ou não:

• Produto na reação com primers “M” ou primers “U”.

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Interpretação dos resultados baseados em MSP.

(A) Esta amostra é composta apenas de células normais (Branco). Essas células normais geralmente têm promotores não metilados (U) para o gene supressor de tumor.

(B) Ambos os alelos das células normais são não metilados, enquanto ambos os alelos das células tumorais são metilados.

(C) Apenas um alelo das células tumorais é metilado.

(D) Esta amostra contém principalmente células tumorais e mostrará um forte sinal de metilação.

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Falsos Positivos/Negativos:

• Erros na conversão com bissulfito podem comprometer a detecção.

Informação Limitada:

• O MSP fornece apenas informações qualitativas;

• Criação do qMSP - quantitativo;

Necessidade de Design Preciso:

• Depende de primers ideais para garantir especificidade.

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Câncer;

Doenças autoimunes;

Síndromes genéticas, como Prader-Willi e Angelman e Síndrome de Beckwith-Wiedemann;

Doenças neurológicas.