# data[].attributes.body
E. coli 에서 Xq peptide를 대량 발현할 수 있다.

# data[].attributes.body
Xq peptide는 ACP이다.

# data[].attributes.body
대량 발현된 Xq peptide를 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 통해

pilot-scale로 정제할 수 있다.

# data[].attributes.body
신종 식물인 쥐꼬리망촛과의 AAB 식물이 발견되었고 이것을 냉차로 마신

강천리 주민들의 암 발병률이 유의미하게 낮았다.

# data[].attributes.body
1. Xq peptide 선정

2. Docking 분석

3. In vitro 실험

CCK-8 assay

4. In vivo 실험

선행 연구

H&E염색, Caspase-3 활성화 분석

# data[].attributes.body
Pilot scale

실험실 규모를 넘어 관련 환경의 규모에서 테스트 된 대표적인 엔지니어링 규모 모델 또는 프로토타입 시스템

발생하는 반응의 모든 세부 사항을 설명하는 반응 데이터와 이론적 모델을 관리하기 쉽고 확장 가능한 것으로 바꾸기 위해

pilot scale이 필요

# data[].attributes.body
K한방연구소 : AAB로 만든 냉차가 암세포의 성장을 억제한다.

S대학교 : AAA와의 comparative genomics를 통해 AAB에 특이적으로 존재하는 눈여겨 볼만한 후보 유전자 X를 찾았다.

SS바이오 : 후보 유전자 X의 protein 발현 및 순수 분리 및 정제에 성공했다.

=> 후보 유전자 X가 X peptide를 만들어내고, X peptide는 Anti-Cancer Peptide(ACP)일 것이라 예상

# data[].attributes.body
식물 유래 항암 peptide/protein 발견 및 안정적인 생산, 정제 기술 개발

우수 항암 유전자의 확보

후보 항암 peptide/protein의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템 개발

후보 항암 peptide/protein의 pilot scale 유용정제법 확립

# data[].attributes.body
protein

서열의 길이가 길어 폴딩 과정이 복잡하고, protein 활성 유지 및 올바른 구조 확인이 필요함.

번역 후 변형(PTM)이 요구되는 protein의 경우, 비용이 더 증가함.

발현 수율이 낮거나 응집체가 형성되면 추가적인 처리 비용이 발생할 수 있음.

3차 구조와 가능성을 유지하면서 정제해야 하므로 고급 기술이 필요함.

peptide

protein보다 크기가 작아 발현 및 정제가 간단함.

대량 생산이 비교적 간단하기에 비용적 측면에서 유리함.

peptide만 발현되면 구조적 안정성이 떨어지고, 세포 내에서 빠르게 분해될 위험이 있음. (His-tag를 붙임으로써 극복 가능)

=> Xq peptide 대량 발현 시스템 개발

# data[].attributes.body
냉차로 만들어도 Xq peptide는 변성되지 않는다.

# data[].attributes.body
AAA 식물은 항암 효과가 없다.

# data[].attributes.body
protein: 50개 이상의 아미노산이 나열돼 있으며, 4차 구조를 형성한 것으로,

여러가지 역할을 수행

-> X protein: X gene으로부터 생성된 전체 단백질

peptide: 50개 이하의 아미노산으로 구성돼 있는 짧은 서열, protein의 기능을 담당하는 부분

-> Xq peptide: X gene이 생성해낸 X protein 중 항암 효과가 있는 일부분

# data[].attributes.body
1. 금속이온친화성크로마토그래피(IMAC)

His-tag

Ligand 종류

2. Ni-NTA

정제 조건 설정

정제 후 순도 분석 방법 선정

실험 시스템-ÄKTA pilot 600 시스템

# data[].attributes.body
Xq peptide 아미노산 서열

LLISLLF

Xq gene 서열

ctcctcatctctcttctcttc

# data[].attributes.body
3. Endotoxin 제거

이온크로마토그래피

4. Native PAGE

Xq peptide 회수 방법

# data[].attributes.body
금속이온친화성크로마토그래피 (IMAC)

protein/peptide가 금속이온과 특이적으로 상호작용

표면에 히스티딘, 시스테인, 트립토판 잔기를 가지고 있는

대부분의 protein/peptide들을 분리

특히, His-tag을 가진 protein 정제에

최적화된 방법

# data[].attributes.body
MTNFTILLISLLFSIAHTCSPCKWQQQQDSCRKQLHGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDHDDDDDHDNHILRTMRGRINYIRRNEGKEEDEEEEGHMQKWCTEMSELRSPKCQCKALQKIMKNQSEELEEKQKKKMEKELINLATMCRFGPMIQCDLSSDD

+NCBI에서 진행

# data[].attributes.body
X protein의 서열 중 항암과 관련된 LIG_BRCT_BRCA1_1 motif를 발견 -> 인식 서열 : ISLLF

1. BRCA1의 BRCT 도메인이 motif의 특정 인산화된 세린(pS)서열을 인식하고 결합

2. 위의 결합으로 인해 도메인이 세포 주기 체크포인트와 DNA 복구 기능에서 중심적인 역할 수행

# data[].attributes.body
1. 생물학적 발현

세균(E. coli), 효모, 곤충, 포유류 등에서 재조합 protein/peptide를 생산하는 방식

장점 : 발현 시스템을 최적화하면 고농도 peptide를 대량 생산할 수 있음.

단점 : 세포의 배양 조건, 발현 벡터 제작 등 초기 세팅 비용이 높음.

2. 화학적 합성

아미노산 간의 peptide 결합을 통해 연결하여 peptide를 합성하는 방식

장점 : 화학적 조합만으로 즉시 설계 및 합성이 가능하며, 최적화 시간이 짧음.

단점 : 아미노산 서열이 길어지면, 합성 효율이 떨어지고 비용이 급격히 증가함.

=> 생물학적 발현 시스템 선정

# data[].attributes.body
3. DNA 손상 발생 시 암세포의 비정상적인 증식을 억제함으로 항암효과 발생

DNA 손상 부위의 신호 분자와 motif가 결합하여 BRCA1을 손상 부위로 유도 -> 체크포인트 protein을 활성화하여 DNA 복구가 완료될 때까지 일시적으로 세포주기 정지 = 항암 효과 발생

# data[].attributes.body
Clapperton et al. (2004) 연구에서 BRCA1의 BRCT 도메인과 인산화된 peptide의 결합 구조를 X-ray 결정학으로 밝힘. 연구진은 합성된 peptide의 짧은 서열이 BRCT 도메인과 결합할 수 있음을 증명

=> Xq pepetide로 항암효과를 낼 수 있다.

# data[].attributes.body
1. X protein 서열을 AntiCP에 입력하고 prediction score가 0.7 이상인 것

3개를 Xq peptide 후보군으로 선정한다.

보통 항암 peptide의 수는 5~15 아미노산이므로 길이를 각각 설정해 10번의 AntiCP 진행

Threshold = 0.7로 설정 시,

0.7 이상 : peptide가 항암 활성 가능성을 가질 확률이 높음

0.5~0.7: 모호한 영역 (더 많은 데이터나 추가 분석 필요

0.5 미만: 항암 가능성이 낮음으로 평가

# data[].attributes.body
선정 기준

1. ISLLF 서열을 포함하고 있는 지

2. AntiCP 분석 결과 높은 prediction score를 가지고 있는 지

=> ISLLF / LISLLF / LLISLLF 을 후보군으로 선정

# data[].attributes.body
1. Alphafold를 사용해 후보군을 3D구조로 모델링한다.

2. RCSB PDB 데이터 베이스에서 BRCA1의 PDB 파일을 확보한다.

3. HADDOCK 사용해 BRAC1의 활성 부위에 후보군이 결합하도록 설정한다. (if. 활성 부위가 명확하지 않다면 전체 protein 표면을 대상으로 설정)

4. Docking 시뮬레이션을 실행해 Binding Energy(ΔG) 계산한다.

ΔG가 낮을수록 표적 protein의 결합력이 강함

표적 protein과 peptide가 어떻게 상호작용하는지 시각화하여 수소 결합, 소수성 상호작용 등 분석 가능

5. ΔG가 가장 낮은 후보군을 최종 Xq peptide로 선정한다.

# data[].attributes.body
ΔG 값

ISLLF : -8.0 kcal/mol

LISLLF : -7.5 kcal/mol

LLISLLF : -9.0 kcal/mol

= LLISLLF가 ΔG가 가장 낮고, 소수성 상호작용을 통해 BRCA1 protein과 강하게 결합

=> 최종 Xq peptide = LLISLLF

# data[].attributes.body
MTT assay

살아있는 세포의 효소가 수용성 MTT염료를 불용성의 포르마잔 결정으로 환원 시키는 원리 이용함. 포르마잔 결정은 용해 과정을 거친 후 흡광도를 측정해 세포 생존율을 확인함. 포르마잔을 용해하기 위해 DMSO 같은 유기 용매를 추가해야 하기에 독성이 가해질 수 있다는 단점이 존재함.

CCK-8 assay

살아있는 세포의 효소가 WST-8 염료를 가용성의 포르마잔으로 변환함. CCK-8은 수용성의 포르마잔을 생성하기에 따로 용매가 필요하지 않고 반응 끝난 직후에 바로 흡광도를 측정할 수 있음.

# data[].attributes.body
=> CCK-8 assay가 MTT assay보다 실험이 간편하고 추가적인 용해 과정이 없어서 시간을 절약할 수 있음. 또한, 적은 양의 세포로도 실험이 가능하고 세포 손상도 적음.

따라서 세포 생존율을 측정하기 위해 CCK-8 assay를 사용함.

# data[].attributes.body
CCK-8 assay 원리

암세포에 Xq peptide를 결합시키고 WST-8 시약을 처리함. WST-8이 세포 내 전자전달 효소에 의해 환원되어 황색 포르마잔을 생성함. 이때 생성된 황색 포르마잔의 OD450값을 측정하고 이 값이 낮을 수록 세포 생존율이 낮다고 할 수 있음.

실험 결과

= OD 450이 0.2~0.5 범위로 낮게 나타남

= 세포 생존율이 50% 이하로 감소했음을 의미

= 암세포에 Xq peptide가 적용되어 암세포의 성장을 억제함

=> Xq peptide는 항암 효과를 나타낸다.

# data[].attributes.body
tag에는 여러 종류가 있지만

보통 길이가 짧아서 클로닝하기 편한 his-tag를 많이 씀

His-tag에 붙는 금속 이온으로는 Cu(II), Ni(II), Zn(II), Co(II) 등을 많이 쓰임

-> 수득률과 순도를 생각해서

수득률이 높고 충분히 washing으로 불순물을 제거할 수 있는 Ni(II)을 쓰기로 결정

# data[].attributes.body
리간드는 구조가 복잡해질수록 비싸짐

Ni-IDA resin: 보통 100 mL에 약 50만원

Ni-NTA resin: 100 mL에 약 100만원

Ni-TED resin: 100mL에 약 170만원

-> 가격과 수율, 순도를 고려했을 때 가장 적합한 리간드는 NTA이기 때문에 실험에서 고수율의 Ni-NTA를 사용

# data[].attributes.body
Ni 이온을 NTA에 공유결합으로 붙인 구조

Ni-NTA를 수지에 결합시켜 친화성 크로마토그래피에 사용

6x-his 중 2개가 Ni 이온과 강하게 결합하는데 이 결합은

약 250mM 농도의 이미다졸에 의해 쉽게 용출이 가능

resin의 용량

: Ni-NTA resin은 1mL 당 5~ 10mg의 his-tagged protein/peptide를 결합할 수 있음

# data[].attributes.body
hybrid conditions -불용성 protein/peptide 정제할 때

+ 정제한 protein/peptide의 기능을 보존해야할 때

--> LLISLLF는 소수성이고, 기능을 보존해야하기 때문에 hybrid conditions으로 진행

# data[].attributes.body
'Alpha Fold2' 를 이용하여 구조예측

# data[].attributes.body
SDS-PAGE의 한계: 열과 SDS를 이용해 peptide가 변성되어 원하는 기능을 하는 peptide를 정제할 수 없음

Native PAGE

peptide 고유의 charge를 이용한 방법. peptide 본래 상태 그대로 실험에 이용할 수 있어

원하는 기능을 하는 peptide를 정제할 수 있음

-> ACP로 사용할 수 있는Xq peptide를 정제해야하기 때문에 고유의 기능을 잃지 않도록 Native PAGE으로 실험 진행

# data[].attributes.headline
가설 1 실험 재료 가격

# data[].attributes.subject
가설 1 실험 재료 가격

# data[].attributes.body
peptide 합성 : 500달러

Cell counting Kit 8(CCK8 1000test): 383,900 - Abcam

Human Caspase-3 ELISA kit : 500달러 - Abcam

H&E 염색 서비스 : 샘플당 20 달러 -> 약 100달러

Total 1,980,330원

# data[].attributes.body
1. 종류:

1. 작은 화학물질 들의 결합에 의한 protein의 변형: 인산화 (phosphorylation), 아세틸화 (acetylation), 메틸화 (methylation)

2. 비교적 큰 분자들의 결합에 의한 변형: 당화 (glycosylation), 지방산화 (예, prenylation), 핵산화 (예, adenylation)

3. protein의 절단(limited proteolysis)에 의한 변형

4. 작은 protein(예, 유비퀴틴, SUMO 등)의 결합에 의한 protein의 변형

-> protein의 종류를 극대화시키고 세포 내에서 그들의 활성, 위치, 다른 분자와의 결합 등을 조절함으로써, 생체 내의 모든 생리적 기능을 제어함.

# data[].attributes.body
ÄKTA pilot 600

유량: 0.1 - 1200 mL/min (최대 20bar)

압력 등급: 최대 20bar

소프트웨어: UNICORN 7

컬럼 범위: 26~200mm id

USP 클래스 VI, 21 CFR 177, 동물성 원료 불포함 또는 EMEA/410/01 준수

프로젝트의 필요에 맞게 쉽게 조정할 수 있고 pilot scale에서

금속이온친화성크로마토그래피를 할 수 있음

# data[].attributes.body
준비물: Guanidium Lysis Buffer, lysate, Denaturing Binding Buffer,  Wash Buffer, Native Elution Buffer, 초음파 장치, 원심분리기

실험 방법

1. 장비 부품 확인 및 Ni-NTA 재료 준비

AKTA Pilot 600 장비의 모든 부품(펌프, UV 검출기, 컬럼 등)이 정상 작동하는지 확인. 필요한 버퍼와 화학물질을 준비한다.

2. 소프트웨어에서 Ni -NTA 세부사항 설정

방법 설정: 소프트웨어의 Method Editor를 열고 새 방법 생성한 후

세부사항(버퍼 조성, 흐름 속도, 컬럼 유형 등)을 설정한다.

# data[].attributes.body
3. AKTA 배관에서 Guanidinium Lysis Buffer 직접 주입할 수 있도록 설정

AKTA Pilot의 배관에서 필요한 Guanidinium Lysis Buffer를 직접 주입할 수 있도록 설정한다.

4. 세포 수확 및 재현탁

시료를 원심분리하여 세포를 수확하고, 준비된 버퍼에 재현탁한다.

# data[].attributes.body
5. 세포 용해 및 초음파 처리

세포를 용해하는 동안 AKTA Pilot에서 펌프를 통해

Guanidinium Lysis Buffer를 주입한다.

초음파 장치를 별도로 사용해 얼음 위에서 세포 용해한다.

6. 원심분리 후 AKTA Pilot 600의 샘플 체계에 시료 추가

고속 원심분리로 세포 찌꺼기를 제거한 후,

AKTA Pilot 600의 샘플 체계에 시료 추가한다.

# data[].attributes.body
7. Lysate 추가 및 Denaturing Binding Buffer, Wash Buffer로 컬럼 세척한다.

AKTA Pilot 600의 디스펜서를 이용해 준비된 lysate를 컬럼에 추가한다.

Denaturing Binding Buffer 및 Wash Buffer로 컬럼을 세척하는 방법을 AKTA Pilot의 소프트웨어에서 설정한다.

8. 펩타이드 용출

Native Elution Buffer를 사용하여 Xq peptide를 용출하고, 이 과정을 모니터링하기 위해 UV 검출기 사용한다.

주의) 실험이 진행되는 동안 AKTA Pilot의 온도와 압력을 지속적으로 모니터링한다.

모든 데이터를 소프트웨어에 기록하고 후속 분석을 위해 적절히 보관한다.

# data[].attributes.body
Musite를 통해 확인

7Leu-13Phe(Xq peptide)에서 예측된 PTM 없음

# data[].attributes.body
Xq peptide에서 PTM이 발생하더라도 이는 Xq peptide의 활성에 영향을 미치지

않는다.

# data[].attributes.headline
박테리아 발현 시스템 vs 식물 발현 시스템

# data[].attributes.subject
박테리아 발현 시스템 vs 식물 발현 시스템

# data[].attributes.body
1. 박테리아 발현 시스템

장점 : 배양 시간이 짧고, 유전자 조작이 쉬우며, 고밀도로 성장하므로 대규모 발현에 적합.

단점 : peptide가 이황화결합과 당화와 같은 번역 후 변형(PTM)을 수행하지 못하기 때문에 불안정성이 증가하고 활성을 상실할 수 있음.

2. 식물 발현 시스템

장점 : peptide가 PTM을 수행할 수 있으며, 식물 내에서 생산된 peptide는 인체에서와 매우 유사한 접힘 형태를 지님.

단점 : 상대적으로 peptide의 발현 정도가 낮고 식물 조직 배양 후 peptide를 얻기까지 시간이 오래 걸림.

=> Xq peptide가 PTM이 일어나지 않기 때문에 박테리아 발현 시스템 선정

# data[].attributes.body
Xq peptide의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템 개발

pDaval에 Xq peptide 유전자 서열을 삽입하고 E. coli를 형질전환하여

Xq peptide를 대량 발현할 수 있다.

# data[].attributes.body
endotoxin

그람 음성균(E. coli)의 세포벽에 존재하는 독성 물질로, LPS로 구성되어 있음

--> E. coli를 사용해서 peptide를 대량발현, 정제할 경우 endotoxin이 아직 남아있을 수 있음.

-> 세균이 죽거나 분해될 때 방출되며 숙주에 염증 반응을 유발하기 때문에 제거 필수

# data[].attributes.body
1. 플라스미드 준비

1. Xq gene 준비:

PCR

제한효소 처리

2. Vector 준비

3. Ligation

2. Transformation

3. Insert 확인

4. pilot scale - 대량 발현

# data[].attributes.body
사용할 plasmid : SS 바이오 연구소의 pDaval

1. 제한효소 선택 : BamHI, HindIII

BamHI, HindIII 선정 이유 : blunt-end를 생성하는 SmaI과 달리 BamHI, HindIII는 sticky-end를 형성하여 ligation 효율을 높임.

BamHI 인식 서열: GGATCC

HindIII 인식 서열: AAGCTT

# data[].attributes.body
endotoxin의 음전하 특성(pH 7.0)을 이용하여 이온 교환 레진에 결합시키는 방법

1. 컬럼 준비

레진은 강염기성 음이온 교환 레진인 Q-레진을 쓴다.

-> endotoxin에 레진이 결합하도록 만듦

2. 버퍼 준비-저염(low salt) 버퍼

염이 너무 높으면 endotoxin과 레진의 상호작용이 감소하여 제거 효율이 떨어질 수 있기 때문에

Tris-HCl 버퍼를 사용한다.

-> 레진에 Xq peptide가 결합하지 않도록 하는 역할

# data[].attributes.body
3. 샘플 적용

정제된 Xq peptide가 포함된 샘플을 컬럼에 적용한다. 이때 Xq peptide는 레진과 상호작용하지 않으면서,

endotoxin은 레진과 결합하게 된다.

4. 세척 및 용출

저염 버퍼로 컬럼을 세척하여 endotoxin을 제거한다. Xq peptide가 포함된 용액은 컬럼에서 빠져나온다.

5. 이후 LAL test 등을 통해 샘플에 남아있는 endotoxin 농도를 확인할 수 있다.

일반적으로 1EU/ml 이하의 endotoxin 농도가 의약품 또는 생물학적 제제에서 인체에 안전한 농도로 간주됨

# data[].attributes.body
2. Forward Primer 설계

5'-GGATCCctcctcatctctcttctcttc-3’

GGATCC : BamHI 인식 서열

ctcctcatctctcttctcttc : Xq gene 서열

길이 : 27

GC 함량 : 51.9%

Tm : 63.29

# data[].attributes.body
실험군: E. coli 에서 발현 후 정제한 Xq peptide

음성 대조군: Xq peptide 없이 동일한 비변성 샘플 버퍼만 로딩

양성 대조군: 가설1 실험에서 구매한 제작된 Xq peptide

# data[].attributes.body
준비물 : Native PAGE 젤(SDS 미사용), 전기영동 장치, native 샘플 버퍼, 전기영동 완충액(Tris-Glycine 등), 염색 용액 및 탈색 용액(Coomassie Blue 등), 전기용출(electro-elution) 장치

실험 방법

1. SDS가 없는 비변성polyacrylamide 젤 준비: SDS가 없는 비변성polyacrylamide 겔을 준비한다.

(예: Tris-Glycine gel 또는 Bis-Tris gel을 사용)

겔을 만들 때 SDS를 포함하지 않으며, 완충액도 비변성 조건을 유지해야 한다.

# data[].attributes.body
3. Reverse Primer 설계

5'-AAGCTTgaagagaagagagatgaggag-3’

AAGCTT : HindIII 인식 서열

gaagagaagagagatgaggag : Xq gene의 역상보 서열

길이 : 27

GC 함량 : 44.4%

Tm : 61.98

4. PCR 최종 산물

GGATCCctcctcatctctcttctcttcAAGCTT

길이 : 33 bp

# data[].attributes.body
2. 샘플 준비: Xq peptide를 비변성 샘플 버퍼에 섞는다.

(예: Tris-HCl, 글리세롤, 브로모페놀 블루를 포함한 버퍼를 사용, SDS는 제외)

3. 전기영동 수행: 전기영동 장치에 비변성 전기영동 완충액(예: Tris-Glycine)을

채운다. 샘플을 로딩한 후, 100~150V에서 전기영동을 진행한다.

Xq peptide가 이동하면서 본래의 구조를 유지한 채로 분리된다.

4. 겔 염색: 전기영동이 완료되면 겔을 Coomassie Blue 염색액에 담가 염색한다.

5. 탈색: 이후 탈색 용액으로 불필요한 염색을 제거한다.

# data[].attributes.body
실험 결과

음성 대조군: 밴드가 없음

양성 대조군: 예상 위치(약 1.2kDa)에 밴드가 나타남

실험군: 양성 대조군과 같은 위치에 밴드가 나타남

=> 대량 발현된 Xq peptide를 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 통해

pilot-scale로 정제할 수 있다.

# data[].attributes.body
Start Codon : ATG

6xHis : CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT

⭕️

BamH1 서열 : GGA-TCC

Xq peptide 서열 : CTC-CTC-ATC-TCT-CTT-CTC-TTC

HindIII 서열 : AAG-CTT

Stop Codon

# data[].attributes.body
pDaval의 6xHis와 MCS사이(⭕️)nucleotide 서열은 3n개 들어있다.(n≥1)

# data[].attributes.body
1. PCR (polymerase chain reaction):

준비물 : 5ul의 10x PCR buffer, 1ul의 deoxynucleotide mix, 제작 primer, 0.5ul의 Taq DNA polymerase, template DNA, 25mM MgCl2

실험 방법:

1. PCR 반응액 조제: X gene, buffer(Taq pol, MgCl 포함), dNTP mix, primer를 tube에 넣는다.

2. Denaturation: 94도에서 15 - 30초 처리해 이중가닥의 DNA를 단일 가닥으로 분리한다.

3. Annealing: primer의 TM값인 62도의 3~5도 낮은 57~59도에서 30초 동안 반응한다.

4. Extension: 72도에서 30초 동안 반응한다.

5. 위 과정을 30~35번 반복

# data[].attributes.body
PCR 결과 확인:

gel electrophoresis로 band 위치 확인한다.

PCR 최종 산물의 크기: 33bp

33bp에 밴드 존재 ⭕️ = Xq gene이 잘 증폭됨

-> 다음 단계로 넘어가기

33bp에 밴드 존재 ❌ = PCR 과정에서 오류가 발생함

-> PCR 재진행 또는 primer 재설계

# data[].attributes.body
2. 제한효소 처리:

준비물 : 10x reaction buffer 4ul, BamHI(20 U/ul) 1ul, HindIII(20 U/ul) 1ul, DNA 시료 20ul, DW 최대 40ul

실험 방법:

1. total volume이 10ul가 되도록 mixture를 제작하기 위해 위의 volume의 PCR용 water을 넣어준다.

2. 절단이 필요한 DNA를 5ul 넣어준다.

3. 제한효소를 넣어준다.

4. Reaction mixture를 섞어준 뒤, 마지막으로 tube 뚜껑을 닫고 tapping으로 섞어준 후 centrifuge로 spin down 시켜준다.

# data[].attributes.body
pDaval은 실험실에 흔하게 존재한다.

# data[].attributes.headline
1. 플라스미드 준비 - 벡터 준비

# data[].attributes.subject
1. 플라스미드 준비 - 벡터 준비

# data[].attributes.body
PCR 산물 제한효소 처리할 때와 같은 방법으로 pDaval도 함께 제한효소인 BamHI, HindIII로 처리 진행

# data[].attributes.body
pDaval의 MCS를 포함한 영역에 LacZ가 위치한다.

pDaval은 lac operon repressor를 발현하는 regulatory gene을 포함한다.

# data[].attributes.body
준비물 : DNase/Rnase free water, 1x Ligation buffer, Ligase

실험 방법:

1. insert gene, vector, ligase와 ligation buffer를 준비한다.

2. Ligation buffer에 vector와 insert를 1:3의 비율로 삽입한다.

3. pipetting 후 centrifuge를 통해 spin down 시킨 후 잘 연결되게 16도에서 30분간 반응시킨다.

# data[].attributes.body
transformation 방법

1. heat shock:

일시적으로 세포막의 투과성을 변화시켜 외부 유전자 유입이 용이하게 만드는 방법으로, 형질전환 효율은 electroporation보다 낮지만 손쉽게 할 수 있는 형질전환법

사용 strain: E. coli HST08 Premium Competent Cells, E. coli DH5α Competent Cells

# data[].attributes.body
2. electrophoresis:

전기적 충격을 통해 세포막의 투과성을 변화시켜 외부 유전자를 도입시키는 방법으로 형질전환 효율은 높지만, 특수한 장비가 필요함.

+ )Competent cell: salt 농도가 낮은 상태로 준비

사용 strain: E. coli HST08 Premium Electro-Cells
, E. coli DH5α Electro-Cells

# data[].attributes.body
Electroporation을 실시하는 경우 ligation 반응액을 에탄올 침전 (필요에 따라 phenol/chloroform 추출 후 에탄올침전법 정제) 으로 정제한 후 형질 전환에 이용하는 과정이 있어야 좋으므로 간단한 방법인 heat shock 방법 진행

-> E. coli HST08 Premium Competent Cells (Code 9128) (이하 C.cells)을 이용하여 형질전환 선택

# data[].attributes.body
heat shock 과정:

1. 얼음위에서 E. coli를 녹인 후, 약하게 섞어 14 ml round-bottom tube (Falcon tube 등)로 옮긴다.

2. E. coli (Competent cell) 100 μl를 1.5 ml-centrifuge tube에 옮긴 후 plasmid DNA 1λ을 가한다.

3. 얼음에 30분간 방치한다.

4. 42℃에서 1분간 heat shock를 가한 후 얼음 위에서 2분 동안 방치한다.

# data[].attributes.body
5. LB 또는 S.O.C 배지 (cat no. EU100-SOC) 1.5 ml 를 가한 후 전체 용액을 test tube로 옮겨 37℃에서 30분 동안 shaking incubation한다.

6. 적정량을 ampicillin, X-Gal, IPTG가 포함되어 있는 LB plate 배지에 도말한 후 37℃에서 overnight 배양한다.

+) X-Gal (Code 9031) working solution 제작 및 plate 도말 방법: dimethylformamide에 20 ㎎/㎖의 농도로 녹인 후 -20℃에 차광하여 보관한다. Plate (φ 9 cm 기준) 당 50 ㎕씩 도말하여 사용한다.

# data[].attributes.body
transformation 후 colony 선별

-> Blue White Screening

plasmid 주입 X : colony 생성 X

plasmid 주입 O : colony 생성 O

Xq gene 삽입 된 colony : white

Xq gene 삽입 되지 않은 colony : Blue

->Xq gene이 삽입 된 colony인 white colony pick

# data[].attributes.body
배양 종류

1. 회분식 배양: 초기에 한 번 배지를 채운 후 더 이상의 영양 물질의 공급이나 제거 없이 세포를 배양하는 방법

2. 유가식 배양: 영양물질은 연속적으로 또는 반연속적으로 공급, 세포 및 생산물을 포함하는 배양액은 불연속적으로 제거 또는 배양 종료시까지 제거하지 않고 배양하는 방법

-> 회분식 배양의 결점을 개선한 방법인 유가식 배양을 선택

# data[].attributes.headline
4. 대량 발현 - 유가식 배양

# data[].attributes.subject
4. 대량 발현 - 유가식 배양

# data[].attributes.body
준비물

1. 배양기(Fermenter)

2. 배지 공급 시스템(포도당 사용)

-E. coli를 생장시켜주는데 사용

-10L 배양에 약 100g 이상의 포도당 필요

(feeding 방식 공급이어서 최소 100g이 필요)

3. 산소 공급(에어레이터)

4. IPTG

-E. coli에서 Lac promoter가 작동하게 하여 peptide 생성하게 해주는 inducer

-최종 농도가 0.2~1.0mM가 되게 할 때, 10L의 배양액에 대해 약 0.4g 필요

# data[].attributes.headline
4. 대량 발현 중간 확인

# data[].attributes.subject
4. 대량 발현 중간 확인

# data[].attributes.body
native page 진행을 위한 실험군, 대조군 설정

실험군: IPTG로 과발현을 유도한 E. coli 펠릿의 Xq peptide 대조군

음성대조군: IPTG를 첨가하지 않은 E. coli 배양액에서 얻은 세포 용해액

양성 대조군: 가설1 실험에서 구매한 제작된 Xq peptide

# data[].attributes.body
선행 연구

식물 유래 항암 peptide/단백질 내 세포 내 delivery system과 동물 실험을 위한 standard protocol (1단계, '20~'22) + H&E 염색, Caspase-3 활성화 분석 함께 진행

실험 결과

= Xq peptide를 처리한 동물의 암종양 크기가 50%이상 감소

= apoptotic 특징(핵 응축 및 분해, 괴사, 염증 반응) 관찰 가능

= Caspase-3 활성화 증가

=> Xq peptide는 ACP이다.

# data[].attributes.body
실험에 필요한 모든 기기는 실험실이 보유하고 있다.

ex) AKTA pilot 600, 에어레이터, fermenter 등

# data[].attributes.body
펩타이드 양 :

CCK-8 assay : 10~20 mg

Caspase-3 ELISA : 10~20 mg

In vivo 실험 : 100~200 mg

발현 및 정제 : 10 mg

순도 : 98%

In vitro, vivo 모두 정밀 분석 과정이며 불순물이 섞여

있으면 정확성과 재연성에 영향을 주고 독성을 유발할 수 있음

가격 : $100~$500 USD

# data[].attributes.attachment_link.description
> 주문형 펩타이드 합성 > 펩타이드 합성 서비스

# data[].attributes.body
대량 배양

1. 초기 배지 준비

100 mL LB 배지에 100 μg/mL 암피실린을 첨가하여 300 mL 멸균 플라스크에 준비

2. 원심분리를 하여 세포 준비 후 배지에 접종

신선한 E. coli 배양액 1 mL씩을 1.5 mL 멸균 튜브 2개에 나눠담고, 6000xg에서 3분간 원심분리 후 상층액 제거

멸균 성장 배지 1 mL로 세척 후 재현탁(2회 반복)

최종 세포 현탁액(2 mL)을 준비된 100 mL 배지에 접종

# data[].attributes.body
Xq peptide 회수 방법 (전기 용출)

1. 겔에서 Xq peptide 밴드 절단: 염색된 젤에서 Xq peptide 밴드를 잘라낸다.

2. 전기용출 장치 사용: 잘라낸 겔 조각을 전기용출 장치에 넣고 완충액을 채운다.

그 후 낮은 전압(예: 100V)으로 Xq peptide를 젤 밖으로 추출한다.

3. Xq peptide 회수 및 농축: 용출된 Xq peptide를 튜브에 모은 후 투석(dialysis) 또는 농축기(centrifugal concentrator)를 사용하여 최종 농축한다.

# data[].attributes.body
3. 유가식 배양 시작

초기 OD600이 0.6~1.0에 도달할 때까지 250 rpm에서 셰이킹 배양

OD600이 0.6에 도달하면 유가식 배양 시작:

포도당 용액 (50% w/v) 또는 글리세롤을 1~2시간 간격으로 소량씩 주입하여 배지 내 탄소원 유지

영양소와 함께 pH를 유지하기 위해 NaOH나 HCl을 첨가

DO(Dissolved Oxygen)를 모니터링하며 산소 농도를 30~50%로 유지(공기 주입 속도 조정)

# data[].attributes.body
4. IPTG 첨가하여 Xq peptide 과발현 유도

IPTG를 최종 농도 0.2~1.0 mM로 첨가하여 Xq peptide 과발현을 유도

IPTG 유도 후에도 유가식 배양 지속

탄소원, 미량원소, 산소 공급을 유지하며 6시간~하룻밤 동안 배양

# data[].attributes.headline
가설2 실험 재료 가격

# data[].attributes.subject
가설2 실험 재료 가격

# data[].attributes.body
primer pair, 25 nmole, 50,000원 (바이오니아)

IPTG 가격 :시약 1g에 75000원->0.4g에 30,000원

E. coli HST08 Premium Competent Cells : 10 x 100uL, 286,000원(TaKara)

Total : 366,000원

# data[].attributes.headline
가설3 실험 재료 가격

# data[].attributes.subject
가설3 실험 재료 가격

# data[].attributes.body
Ni-NTA resin 100ml: 100만원

[GenDEPOT] Native Sample Buffer (4X) 20ml: 71500원

NativePAGE™ Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 10-well: 347000원

Q-resin 100ml: 151만 7700원

Tris-HCl buffer: 17만 3,159원

Tris-Glycine buffer: 18만 4,730원

Coomassie Brilliant blue: 86,681원

(나머지 기기 및 젤은 실험실에 있는 것으로 가정)

Total 3,033,770원

# data[].attributes.body
1. http://elm.eu.org/

2. http://elm.eu.org/elms/LIG_BRCT_BRCA1_1.html

3. https://www.ksmcb.or.kr/file/webzine/2016_01_01.pdf

4. https://m.blog.naver.com/tfs_biotech/221788975304

5. https://www.takara.co.kr/web01/product/productList.asp?lcode=L230118

6. https://takara.co.kr/web01/studio/bookcase.asp?Stid=Book003

7. https://patentimages.storage.googleapis.com/1a/31/45/868a1d42438638/KR100907278B1.pdf

8. https://chemistry.callutheran.edu/tiki-index.php?page=protein+purification

9. https://blog.naver.com/wondrous_world/222592834939

10. https://blog.naver.com/wondrous_world/222592834939

11. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/brochures/tools-reagents-recombinant-protein-purification-brochure.pdf

12. https://yfl.yonsei.ac.kr/l_system/eo_2.do?mode=download&articleNo=101929&attachNo=86765

13. https://biosci.tistory.com/10

14. https://www.lawinsider.com/dictionary/pilot-scale

15. https://m.blog.naver.com/kist_public/221577431116

16. https://www.linkedin.com/pulse/why-you-need-pilot-plant-stephen-benbrook

17. https://www.jobkorea.co.kr/Starter/interview/LayerView/21510?showHidden=TRUE

# data[].attributes.body
5. 세포 수확 및 세척

배양이 완료되면 8000 xg에서 5분간 원심분리하여 세포를 수확

수확된 세포를 냉각된 0.9% NaCl로 2회 세척(재현탁 후 원심분리 반복)

6. 세포 파쇄 및 Xq peptide 추출

수확한 젖은 세포 펠릿(0.5~3 g)을 추출 버퍼 15mL에 재현탁한 후, 냉동-해동 과정을 반복하여 세포를 파쇄

필요시 초음파 분쇄기(sonicator)나 고압 균질기 사용

7. Native PAGE 분석

추출된 Xq peptide를 Native PAGE로 분석하여 발현 및 상태를 확인

# data[].attributes.body
실험 결과

음성 대조군: 밴드가 없음

양성 대조군: 예상 위치(약 1.2kDa)에 밴드가 나타남

실험군: 양성 대조군과 같은 위치에 밴드가 나타남

=> Xq peptide를 대량 발현할 수 있다.