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Mateus Henrique

Matheus Ferrari

Pedro Antônio Aguiar

Thays Millena

Thiago André

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As bactérias Gram-positivas (Gram+) possuem uma parede celular formada por múltiplas camadas de peptideoglicano, que conferem espessura e estabilidade à estrutura. Em contraste, as Gram-negativas (Gram-) têm uma parede celular mais complexa, composta por uma fina camada de peptideoglicano, situada entre o periplasma e uma membrana externa de composição lipídica. Essa membrana externa é desestruturada pela ação do álcool durante o processo de descoloração, o que causa a perda do Cristal Violeta e, posteriormente, a coloração pela Fucsina em rosa distinguindo-as das Gram+.

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Lâmina corada em roxa, indicando a presença de bactérias Staphylococcus Aureus Gram+

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Cultura bacteriana, lâmina de vidro, kit de coloração de Gram, água destilada, bacia, suporte para colocar a lâmina, prendedor, alça bacteriológica, solução salina, óleo de imersão, microscópio óptico.

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Colocamos uma gota de solução salina em uma lâmina de microscópio limpa e adicionamos uma colônia do meio de cultura em placa. Espalhamos na lâmina com movimentos circulares com auxílio da alça bacteriológica. Passamos a lâmina com o esfregaço sobre a chama do Bico de Bunsen até que este esteja completamente seco. Após isso, adicionamos Cristal Violeta na lâmina por 1 minuto para corar todas as bactérias presentes em roxo. Em seguida, retiramos o excesso e adicione Lugol por 1 minuto, que atua como mordente. Lavamos com água destilada, aplicamos álcool para descolorir as bactérias gram-negativas, o que ocorre devido à composição da parede celular, e lavamos novamente com água destilada. Em seguida, adicionamos Fucsina para corar as Gram-negativas em rosa. Após tudo isso, a lâmina foi lavada e levada ao microscópio óptico para observação em objetiva de 100x.

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Esse processo precisa ser realizado em ambiente asséptico, ao lado do Bico de Bunsen.

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Observar a ação antimicrobiana do sabão, álcool 70% e álcool iodado

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No caso do meu grupo observamos a coloração em roxo indicando a presença de bactérias Gram+ na nossa Coloração de Gram.

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Placa em meio de cultura rico, foi incubada a 37 °C/overnight em aerobiose.

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1. Dedo sem higienização;

2. Lavagem com água e sabão por 1 minuto;

3. Uso de álcool 70% por 1 minuto;

4. Uso de álcool-iodado na pele por 1 minuto.

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Placa com o meio de cultura seletivo indicador Ágar Manitol Salgado, swab estéril.

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TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS
(ANTIBIOGRAMA)

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O antibiograma é um exame laboratorial utilizado para identificar a sensibilidade ou resistência de bactérias a diferentes antibióticos, auxiliando na escolha do tratamento adequado para infecções bacterianas. Esse teste é crucial para orientar o uso racional de antibióticos e combater a resistência bacteriana.

Este procedimento detalha o método para realizar um antibiograma usando a técnica de difusão em disco com meio de cultura Müller-Hinton. Aqui está o resumo dos passos:

1. Preparação da Suspensão Bacteriana:

Foi utilizada uma cultura bacteriana Staphylococcus aureus (Gram+), preparando uma suspensão em solução salina.

Com uma alça bacteriológica, adicionamos a bactéria até a turbidez da suspensão se aproximar ao padrão da escala 0,5 de McFarland, o que indicaria uma concentração uniforme de células bacterianas.

2. Inoculação da Placa:

Foi mergulhado um swab estéril na suspensão bacteriana preparada.

Posteriormente, em uma placa de ágar Müller-Hinton, espalhamos o swab com a suspensção bacteriana em vários locais diferentes para garantir uma distribuição uniforme das bactérias sobre o meio de cultura.

3. Aplicação dos Discos de Antimicrobianos:

Com uma pinça esterilizada, colocamos discos de papel impregnados com diferentes antibióticos sobre a superfície da placa inoculada.

Os discos forma posicionados de modo a manter uma distância adequada entre eles, evitando a sobreposição das zonas de prevenção.

4. Incubação:

Por fim, a placa foi incubada em estufa a 37 °C por 24 horas em condições de aerobiose (na presença de oxigênio).

Após a incubação, observamos e medimos as zonas de proteção ao redor dos discos de antibióticos para determinar a suscetibilidade ou resistência da bactéria aos antimicrobianos testados. Novamente, esse método é fundamental para uma análise confiável da ação antimicrobiana e para direcionar o tratamento clínico adequado. Importante destacar que todo procedimento até a incubação deve ser feito em meio asséptico, ao lado do Bico de Bunsen, a fim de evitar possíveis contaminações.

De acordo com a imagem, realizamos a medição do halos de inibição de para verificar a sensibilidade das bactérias aos seguintes antimicrobianos:

GEN 10 - 1,4cm (resistente)

VAN 30 - 1,3cm (não é possível afirmar)

AMC 30 - 1,8cm (sensível)

CFE 30 - 2,0cm (sensível)

MER 10 - 2,4cm (sensível)

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No geral, o resultado foi o que era esperado.

No espaço do dedo sem higienização, foi observado grande crescimento microbiano, com colônias maiores e mais dispersas.

No espaço da lavagem com água e sabão, foi visto menor crescimento que o espaço sem higienização, mas ainda haviam colônias e estavam bem visíveis.

No espaço do uso de álcool 70%, já era mais difícil ver o crescimento, estando as colônias menores e mais isoladas

No espaço do uso de álcool-iodado, não foi visto nenhum crescimento microbiano.

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Pesquisar a presença de bactérias na mucosa nasal, visando identificar a possível presença da bactéria Staphylococcus aureus.

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A S. aureus é sensível ao antimicrobiano GEN (gentamicina) para diâmetro maior do que 18 mm, e no caso do nosso teste o diâmetro observado foi de 14 mm. Assim, o experimento aponta a resistência da S. aureus ao GEN.

No caso de VAN (vantamicina), o método disco-difusão não é confiável e não distingue isolados selvagens daqueles com resistência não mediada pelo gene vanA da S. aureus.

Para AMC (amicacina), a bactéria é sensível caso o diâmetro seja maior do que 15 mm, e nossa observação foi 18 mm. Desse modo, a S. aureus é sensível ao AMC.

O CFE (cefepima), assim como outros carbapenêmicos, tem sensibilidade em relação aos estafilococos inferida pela sensibilidade à cefoxitina. Assim, como o diâmetro observado foi 24 mm e a sensibilidade pode ser constatada para diâmetros maiores do que 22 mm, a S. aureus é sensível à cefepima.

Para MER (meropenem), a sensibilidade da S. aureus é também inferida a partir da sensibilidade à cefoxitina. O diâmetro observado foi 24 mm e a sensibilidade pode ser constatada para diâmetros maiores do que 22 mm. Por isso, a S. aureus é sensível a cefoxitina e, por consequência, ao MER.

Fonte: Tabelas de pontos de corte para interpretação de CIMs e diâmetros de halos, brCAST, 2024.

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Meio de ágar manitol salgado com proliferação de bactérias S. aureus

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A proliferação de bactérias no meio de cultura indica a presença de Staphyloccocus aureus na mucosa nasal, pois o meio é seletivo para espécies halotolerante como esta, uma vez que contém 7,5% de NaCl.

Além disso, a S. aureus utiliza o manitol como fonte de energia. A fermentação deste açúcar induz a acidificação e mudança de cor no meio de vermelho para amarelo, tal como observado, através do indicador vermelho de fenol. Portanto, o indivíduo está colonizado por Staphyloccocus aureus.

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Os quatro experimentos realizados com diferentes tempos de exposição ao ar mostraram resultados esperados e coerentes, visto que a placa com maior tempo de exposição apresentou mais Unidades Formadoras de Colônias (UFC) em comparação às placas com tempos de exposição menores. Entre 15 e 25 minutos, não foi observada alteração visível na quantidade de bactérias viáveis (medido pelo número de UFC) nas amostras. Além disso, podemos observar diferença no diâmetro das colônias e, com isso, temos um indicativo de diferença de espécies, pois, havendo proximidade entre elas e o tempo de incubação sendo o mesmo, podemos inferir que são espécies diferentes que crescem com ritmos diferentes, por exemplo. Um caso em que isso fica mais evidente é na lâmina com 25 minutos de exposição, onde observamos claramente 2 UFC próximas com diâmetros diferentes. Assim, podemos supor que se tratam de espécies diferentes. Nos demais casos, as imagens não são suficientemente nítidas para fazermos tais observações. Também vale destacar que foi utilizado um meio de cultura rico que, pela ampla oferta de nutrientes, não permite identificar tipos específicos de bactérias tão facilmente. Para diferenciar as bactérias, recomenda-se o uso de um meio de cultura seletivo e/ou indicador, que permite isolar e identificar microorganismos.

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Quando o sabão entra em contato com a membrana bacteriana, suas moléculas anfipáticas — com uma parte hidrofóbica e outra hidrofílica — causam a desestruturação das membranas lipídicas das bactérias. A porção hidrofóbica se insere na membrana citoplasmática (e na membrana externa das Gram-), enquanto a porção hidrofílica se orienta para a água. Essa ação provoca a dissolução dos lipídeos da membrana, levando à desorganização estrutural e, consequentemente, à morte da bactéria.

O álcool a 70% possui uma concentração ideal para efeito bactericida. Nesta concentração, a presença de água facilita a penetração do álcool nas células bacterianas e retarda sua volatilização, permitindo um maior tempo de contato. O álcool atua na desnaturação das proteínas do microrganismo.

No caso do álcool iodado, o efeito bactericida do iodo se dá por alterações no ácido nucléico e interferências na síntese proteica bacteriana. O iodo promove também a desnaturação de proteínas essenciais, interrompendo funções vitais e levando à morte do microrganismo.

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Swab 1 - Mucosa bucal: Considerando que a mucosa bucal é conhecida pela alta variedade e quantidade de microorganismos, o grupo foi surpreendido, pois não foi formada colônia de bactérias visível.

Swab 2 - Orelha: Em oposição à mucosa bucal, não era esperado uma alta quantidade e variedade de bactérias na orelha. Sendo assim, a alta formação de colônias visíveis surpreendeu o grupo.

Superfície 1 - Chaveiro: Foi observado muitas formações de colônia, tal como esperado, devido ao frequente contato do objeto com as mãos

Superfície 2 - Relógio: Foi observado que as colônias formadas seguem o formato da superfície do objeto.