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Ha pasado unas semanas, un quiz y para algunos, un parcial, pero estamos seguros que aún recuerdas el significado de las siglas PCR...¿cierto? ...mmmm..🤔
Bueno significan Reacción en Cadena de la Polimerasa, por supuesto estamos hablando de la DNApolimerasa y no de cualquier polimerasa. Recordarás que esta técnica permite amplificar específicamente cualquier segmento de ADN presente en un genoma, es decir cualquier locus de cualquier cromosoma. Como es una reacción de duplicación en cadena, es decir una duplicación tras otras, se puede multiplicar la cantidad del fragmento amplificado en torno a 1000 millones de veces (10⁹). Así, esta técnica creada a mediados de los 80's (cotemporanea de la consola Atari, del juego PacMan, de E.T. el extraterrestre, del grupo musical Genesis y ..bueno no nos desviemos y regresemos al tema),  revolucionó a la biología y la genética, al permitir el conocimiento de los genes, y de los genomas (gracias a la PCR, la secuenciación de genomas completos se volvió un reto alcanzable tan sólo una década después del invento de la PCR), facilitando también la obtención de ADN recombinante, y multiplicando  las diversas aplicaciones biotecnológicas  asociadas con clonación molecular e ingeniería genética.

Lo que caracteriza a la PCR es su sencillez de realización, su versatilidad pero sobre todo su alta sensibilidad y especificidad, pues con ese poder de amplificación, basta con muy pocas cantidades de moléculas de ADN molde para obtener una amplificación de un fragmento del mismo.

En cuanto a la especificidad, esta la brindan los iniciadores o primers que requiere la DNA polimerasa para poder iniciar la copia de cada cadena, y se basa en la propiedad de hibridación o complementariedad entre las secuencias de los primers y las cadenas del ADN molde.

Otra propiedad empleada en la reacción de PCR es la capacidad de desnaturalizar el ADN a altas temperaturas, lo cual permite separar las cadenas de la doble hélice sin necesidad de helicasas ni de topoisomerasas, ni de SSBPs (si no recuerdas qué hacen estas proteínas, te invitamos a repasar la replicación del ADN dentro de la célula).

Finalmente, un último aspecto clave a tener en cuenta es que como se desnaturaliza a altas temperaturas, la DNApolimerasa no puede ser cualquiera, es decir debe ser una enzima que tolere estas altas temperaturas sin que ella misma se desnaturalice (pierda sus estructura tridimensional y su actividad, como consecuencia de las altas temperaturas). Esto se solucionó al emplear una DNApolimerasa purificada de un microorganismo termofílico aislado de manantiales de aguas termales que se encuentran normalmente a 72°C, con lo cual  sus proteínas son termoestables y resisten la temperatura empleada para desnaturalizar el ADN. Así, la reacción de duplicación puede repetirse varias veces en lo que se conoce como ciclo de duplicación o amplificación.

Pero bueno ya que hemos repasado la PCR ahora te toca a tí recordar...Hablamos de temperaturas, hablamos de ADN molde, hablamos de primers y de DNApolimerasa termoestable...entonces ¿podrías recordar cuáles son los pasos y temperaturas que se emplean en un ciclo de duplicación en PCR?🤔

Y, ¿ cuántos ciclos contiene generalmente (aproximadamente) una reacción o ensayo de PCR? 👾

De la misma manera, ¿podrías indicar cuáles son los diferentes ingredientes que contiene una reacción de PCR y que se añaden a ese diminuto tubo de PCR? (ver foto del tubo arriba)...

Te invitamos a recordar estos aspectos...🧠 y bueno, si no lo tienes claro, te proponemos también  visualizar el siguiente video: Haz clic aquí: 👀

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Pero la PCR no sólo se aplica al diagnóstico de infección por virus y bacterias. Igualmente, permite identificar variaciones o polimorfismos genéticos existentes entre individuos en un locus determinado del genoma. Esto último se aplica en estudios filogenéticos o de biología evolutiva, en ecología molecular, genética de poblaciones o biogeografía, pero también es de gran aplicación  en estudios clínicos, cuando se logra encontrar una asociación entre una determinada variación de secuencia  en un locus y cierta probabilidad de desarrollar alguna patología: ahí es donde el genotipado molecular adquiere un valor diagnóstico o pronóstico en el ámbito clínico.
Los polimorfismos de ADN son de diferentes tipos: los más frecuentes son cambios de un sólo nucleótido conocidos como SNP (Single Nucleotide Polimorfism), seguido por inserciones o deleciones en gran medida generadas por la actividad de transposones o elementos transponibles,  o variación en el número de copias tanto de secuencias repetitivas cortas, como de genes completos.
Hoy la tendencia es cada vez más hacia un "genotipado global" basado en secuenciación del genoma personal completo, o de la fracción codificante del mismo (el exoma). Lo anterior se debe al auge de las plataformas de secuenciación de alto rendimiento en los ultimos 15 años, lo que nos lleva a grandes pasos hacia la medicina personalizada.

Sin embargo el genotipado de locus específico basado en PCR, sigue siendo vigente, al ser muy confiable, relativamente sencillo de realizar o interpretar, así como por su muy bajo costo.
Mira este corto video (publicitario, pero no nos pagan por eso😕 ....es con fines ilustrativos) de una empresa que realiza secuenciación genómica personal...entenderás que es equivalente a un genotipado de todos los loci de tu genoma simultaneamente...y estos servicios ya son una realidad!

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En la práctica de laboratorio te propondremos realizar el genotipado de un locus polimórfico en la población humana: el locus PV92, el cual se ubica en el cromosoma 16.
El polimorfismo de este locus se debe a que puede sufrir o no una inserción de un elemento transponible denominado Alu, sin embargo  a pesar de su polimorfismo de inserción, se considera un locus neutral ya que una posible inserción no está asociada con ninguna alteración fenotípica. Los elementos Alu constituyen el grupo más abundante de elementos repetitivos dispersos presentes en nuestro genoma y el de los primates en general. Este tipo de elementos repetitivos dispersos en nuestro genoma pertenece a la clase de los SINES (Short Interspersed Nuclear Elements), los cuales son elementos transponibles que derivan de una clase de retrotransposones denominados de cola poliA.

Al ser elementos transponibles, los elementos Alu pueden saltar e  insertarse en nuevos loci del genoma y causar mutaciones responsables de enfermedades genéticas hereditarias y/o cáncer, sin embargo, no hay motivo para alarmarse ya que menos del 0.5% de estos elementos logra activarse y además la mayoría de las nuevas inserciones no suelen tener algún efecto negativo.
De este modo, el estudio de los elementos Alu y del historial de sus inserciones ha servido mucho para esclarecer la historia evolutiva del genoma de los primates y del ser humano, ya que es un elemento muy fácil de identificar y seguir a lo largo de generaciones así como en muestras de ADN fósil.
La enorme mayoría de copias o inserciones Alu se conserva entre primates, si bien hay unas 7000 inserciones propias de Homo sapiens. Así, un individuo comparte una misma inserción Alu en un sitio particular con otro individuo si los dos tienen un ancestro común: usando cada una de las copias de este elemento, la cual está insertada en un locus diferente, se puede lograr reconstruir con gran detalle, las relaciones de ascendencia entre individuos a lo largo de generaciones.

Creemos que en este punto, es importante aprovechar para realizar un ejercicio de búsqueda final muy sencilla 🧐, el resultado de la búsqueda lo debes traer el día del laboratorio ya que iniciaremos con la socialización de los resultados de esta búsqueda....
Según la primera letra de tu primer apellido y orden alfabético, realiza sólo una de las siguientes búsquedas:

🕵️‍♂️  Letras A a D: Averigua cómo es el mecanismo de transposición de los transposones de cola poliA.

🕵🏾‍♀️ Letras E a I:  Buscarás qué son las secuencias SINEs en nuestro genoma, su abundancia  y qué las diferencia de las secuencias LINEs.

🕵🏻‍♀️Letras J a O:  indagarás acerca de qué enfermedades hereditarias o tipos de cáncer se han asociado con  inserciones de elementos Alu.

🕵🏻‍♂️ letras P a Z:  buscarás cuántas copias de elementos Alu existen en forma dispersa en nuestro genoma,  qué tamaño en pb tiene un elemento Alu, y qué porcentaje de nuestro genoma representan estos elementos Alu en su totalidad.
... ⏱🤯

Anota las respuestas y tráelas para socializarlas juntos en la próxima sesión de laboratorio remoto. Gracias!

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Ahora que recordamos bien lo que es la PCR,  entendemos que, al ser una técnica que permite amplificar un locus particular del genoma, sirve para detectar la presencia de una secuencia particular en una muestra biológica, lo que se aplica para detectar presencia de un patógeno específico por ejemplo en fluidos corporales (sangre, saliva, orina, etc..), en aguas, suelos o alimentos.
Te proponemos justamente ver este corto video que te explicará cómo se emplea la PCR, en este caso, cuantitativa (qPCR), acoplada a una transcricpción inversa   (Reverse Transcription, abreviada RT en inglés) con el fin de poder amplificar, detectar y cuantificar la presencia de un ARN específico, como es el caso del genoma del coronavirus SARS-Cov-2. Esta variación a la PCR para amplificar ARN se conoce como RT-PCR y si es cuantitativa, se denomina RT-qPCR.

Entonces, ¿ ya tienes claro que la prueba de detección de infección por SARS-cov2 (COVID) conocida como "prueba PCR" es en realidad una prueba RT-qPCR? 🤔 ...