# data[].attributes.body
AAB로 만든 냉차가 암세포의 성장을 억제한다는 결과 얻음

여러 후보 유전자 중 X가 X peptide를 만들어 낸다.

X peptide가 세포안에서 암세포의 증식을 억제하고, 종양 억제 유전자를 활성화하는 효과가 있을 것 같다

X peptide = anti-cancer peptide라 믿음

# data[].attributes.body
ss바이오에서는 X/pDaval plasmid를 100 ug 보유 중이다

# data[].attributes.headline
후보 항암 peptide/protein의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템

# data[].attributes.subject
후보 항암 peptide/protein의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템

# data[].attributes.body
X peptide/protein를 효과적으로 대량 생산 하기 위한 방식은 식물 세포 배양 시스템을 이용한 방식일 것이다.

-> SS바이오에서 진행

# data[].attributes.body
SS 바이오는 X-GFP/pMancal plasmid를 100 ug 보유 중이다

# data[].attributes.body
SS바이오는 X/pManval plasmid를 100ug 보유 중이다.

# data[].attributes.body
식물 유래 항암 peptide/단백질의 세포내 delivery system과 동물 실험을 위한 standard protocol

# data[].attributes.headline
SS바이오는 연구비로 3억2천만원을 사용

# data[].attributes.body
SS바이오는 연구비로 3억2천만원을 사용할 수 있다

# data[].attributes.body
peptide

표적 항암 치료제

안정성 낮음

protein

광범위한 항암 치료제

안정성 높음

# data[].attributes.headline
선임연구원의 연구노트1

# data[].attributes.subject
선임연구원의 연구노트1

# data[].attributes.body
E. coli의 형질전환

: vevtor에 후보유전자 X gene을 Smal 유전자 사이에 끼워넣고 이 plasmid를 E. coli에 transformation 하여 X peptide를 대량으로 생산하였다.

# data[].attributes.body
요소

plasmid vector : 발현 유전자, promoter, RBS(리보솜 결합 부위), selection marker

host : Rosetta, C41, C43과 같은 변형 E. coli

# data[].attributes.headline
선임연구원의 연구노트2

# data[].attributes.subject
선임연구원의 연구노트2

# data[].attributes.body
Affinity chromatography

: 앞의 실험을 통해 E. coli에서 X peptide를 대량으로 생산한 뒤, 이를 Ni-NTA (Nitrilotriacetic acid) 크로마토그래피를 이용하여 X 단백질만을 분리했다.

(Ni-NTA 크로마토그래피는 세균, 곤충 및 포유동물 세포에서 발현되는 6xHis-tag 재조합 단백질의 정제를 위해 사용된다.)

# data[].attributes.headline
선임연구원의 연구노트3

# data[].attributes.subject
선임연구원의 연구노트3

# data[].attributes.body
식물의 형질전환

: X-GFP fusion 단백질을 만들도록 plasmid를 만든 후 이를 식물에 직접 넣어 식물에서 X 단백질이 발현되도록 만들었다.

이때 사용한 plasmid는 앞의 실험에서 E. coli에 넣어준 것과는 다른 plasmid이며 이는 식물의 형질전환이므로 Ti plasmid를 사용했을 것으로 예상된다.

# data[].attributes.headline
선임연구원의 연구노트4

# data[].attributes.subject
선임연구원의 연구노트4

# data[].attributes.body
항체 chromatography

: sepharose에 Anti-GFP 항체를 붙인 resin을 사용하여 chromatography를 진행한다. 이를 통해 앞의 실험에서 GFP를 fusion시킨 X 단백질만을 정제할 수 있다.

# data[].attributes.body
광범위 효과 목적으로 사용

Advantage

- 특이성과 안정성이 높아 여러 암 유형에 효과

- 복잡한 작용 기전으로 광범위한 항암 효과

Disadvantage

- 생산 과정 복잡 비용 높음

- 대사 안정성이 상대적으로 낮음

# data[].attributes.headline
선임연구원의 연구노트5

# data[].attributes.subject
선임연구원의 연구노트5

# data[].attributes.body
GFP가 fusion된 X단백질을 식물에 실제로 과발현시켜 X 단백질을 대량생산 하였다.

(nicotiana benthamiana)

# data[].attributes.headline
식물 단백질 발현 시스템

# data[].attributes.subject
식물 단백질 발현 시스템

# data[].attributes.body
특정 유전자를 식물 세포에 도입하여 목표 단백질을 대량 생산 하는 과정

# data[].attributes.body
표적 치료 목적으로 사용

Advantage

- 세포 내 투과성 높음

- 생산비용 낮고 합성이 용이

Disadvantage

- 체내 안정성 낮음 : 빠르게 분해

- 작용 메커니즘 단순 : 일부 암 유형에 효과적

# data[].attributes.headline
X-GFP / pManval plasmid construct for expression and purification in plan

# data[].attributes.subject
X-GFP / pManval plasmid construct for expression and purification in plan

# data[].attributes.headline
선임연구원의 연구노트6

# data[].attributes.subject
선임연구원의 연구노트6

# data[].attributes.body
X gene sequence

atgaccaacttcacaatcctcctcatctctcttctcttctccatcgcccacacttgcagcccctgcaaatggcagcagca gcaagatagctgccgcaagcagctccacggggtcaacctcacgccctgcgagaagcacatcatggagaagatccaaggcc gcggcgatcacgatgatgatgatgaccacgacaatcacattctcaggaccatgcggggaagaatcaactacataaggagg aacgaaggaaaagaggaagacgaagaagaagaaggacacatgcagaagtggtgcacagaaatgagcgagctgagaagccc caaatgccagtgcaaagcgctgcagaagataatgaagaaccagagcgaggaactggaggagaagcagaagaagaaaatgg agaaggagctcattaacttggctactatgtgcaggtttggacccatgatccagtgcgacttgtcctccgatgact

# data[].attributes.body
hisotone asetylation이랑 apoptosis 유도로 항암 효과 발휘

peptide로 작용할 경우

생체 내 안정성이 낮음

흡수 효과 낮음

=> protein으로 작용할 때 더 효율적일 것이라는 가설 제시

# data[].attributes.attachment_link.title
Scalable Purification and Characterization of the Anticancer Lunasin Peptide from Soybean

# data[].attributes.attachment_link.description
Lunasin is a peptide derived from the soybean 2S albumin seed protein that has both anticancer and anti-inflammatory activities. Large-scale animal studies and human clinical trials to determine the efficacy of lunasin in vivo have been hampered by the cost of synthetic lunasin and the lack of a method for obtaining gram quantities of highly purified lunasin from plant sources. The goal of this study was to develop a large-scale method to generate highly purified lunasin from defatted soy flour. A scalable method was developed that utilizes the sequential application of anion-exchange chromatography, ultrafiltration, and reversed-phase chromatography. This method generates lunasin preparations of >99% purity with a yield of 442 mg/kg defatted soy flour. Mass spectrometry of the purified lunasin revealed that the peptide is 44 amino acids in length and represents the original published sequence of lunasin with an additional C-terminal asparagine residue. Histone-binding assays demonstrated that the biological activity of the purified lunasin was similar to that of synthetic lunasin. This study provides a robust method for purifying commercial-scale quantities of biologically-active lunasin and clearly identifies the predominant form of lunasin in soy flour. This method will greatly facilitate the development of lunasin as a potential nutraceutical or therapeutic anticancer agent.

# data[].attributes.body
Lunasin sequence

SKWQHQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD

ORF1 sequence

MTNFTILLISLLFSIAHTCSPCKWQQQQDSCRKQLHGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDHDDDDDHDNHILRTMRGRINYIRRNEGKEEDEEEEGHMQKWCTEMSELRSPKCQCKALQKIMKNQSEELEEKQKKKMEKELINLATMCRFGPMIQCDLSSDD

# data[].attributes.body
모든 ORF1의 peptide들에서 항암효과 발견

가정 : x peptide/protein는 protein으로 작용할 경우 더 강한 항암효과를 가진다.

=> protein의 형태로 pilot-scale에서 발현 및 정제

# data[].attributes.body
1. 생산 속도와 비용

E. coli system이 모두 우수함

식물 system은 초기 유전자 변형 및 발현 시스템 구축 비용 발생

E. coli system은 수일 내 결과 확인 가능하지만,

식물은 수 주에서 수 개월 단위의 시간을 필요로 함

# data[].attributes.body
2. post-translation 수정 가능성

단백질 내 당화나 이황화 결합이 필요한 경우 식물 system을 이용하는 것이 적합함

E. coli system은 단백질 folding이 적절히 되지 않을 수 있음

E. coli system은 당화와 같은 post-translation의 수정이 어려움

식물 system은 post-translation의 활발한 수정이 가능함

# data[].attributes.body
실험적 방법으로도 알 수 있으나,

소프트웨어를 통해 당화 가능성을 미리 예측할 것임

먼저 X gene sequence와 NCBI ORF finder를 사용해

아미노산 서열을 구함

4개의 ORF가 모두 존재한다는 의미는 아니며,

가장 긴 서열인 ORF1이 해당 단백질을 암호화할 가능성 높음

→ BLAST로 앞서 구한 아미노산 서열의 신뢰성을 확인함

# data[].attributes.body
1. Max score와 Total score는 높을수록 유사함

짧은 서열(50~200bp)은 Max Score ≥ 50 (230은 매우 높은 값)

긴 서열(200bp 이상)은 Max Score ≥ 200 이상

2. Quary cover 100%

입력 서열과 데이터베이스의 subject 서열이 전 구간 일치함

3. E-value 낮을수록 유사함

2e-77은 거의 "0"에 가까운 값임

입력 서열이 Subject 서열이 우연히 일치할 가능성은 사실상 없다고 간주할 수 있음

4. Identity = 93.04%

90% 이상이면 실제 단백질이나 유전자 기능이 비슷할 것으로 간주함

# data[].attributes.body
사용한 소프트웨어: DTU health tech의 NetNGlyc

N-당화 가능성이 매우 높아 빨간색으로 표시됨

# data[].attributes.body
사용한 소프트웨어: DTU health tech의 NetOGlyc

일반적으로 Serine(Ser) 또는 Threonine(Thr)

자리에 o-당화 가능성이 높음

→ Ser,Thr 자리에 #positive 표시

# data[].attributes.body
3. 안전성

의약품, 치료용 단백질과 백신 등에 식물 system을 널리 사용함

식물 system은 병원성 세균이나 바이러스 등을 활용하지 않음

E. coli system은 E. coli가 생성하는 endotoxin의 제거가 필요함

*endotoxin: 의약용 단백질은 허용 농도가 5 EU/kg 체중 (EU: Endotoxin Unit) 이하로 매우 엄격함

# data[].attributes.headline
X단백질로 추정되는 단백질

# data[].attributes.subject
X단백질로 추정되는 단백질

# data[].attributes.body
Glycine max(대두)로부터 유래한

2S seed storage albumin protein

*BLAST 결과 100% 일치하는 subject 서열의 accession number를 이용해 추정함

# data[].attributes.body
-> Nicotiana benthamiana로 선정

대량 생산에 가장 특화된 Nicotiana benthamiana

니코틴 등의 독성 물질 제거 기술 많이 발전

바이러스 감염은 엄격한 생장 환경을 통해 방지

X protein을 과발현 시킨 N. benthamiana를 보유 중

형질전환이 용이하고 배양하기 쉬움

성장속도가 빠름

# data[].attributes.body
Transient :

외래 유전자를 일시적으로 발현

agrofiltration 통해 소규모 혹은 대규모로 일시적인 단백질 발현

제품 개발에 필요한 시간을 획기적으로 단축하는 기술

장기간 생산에 부적합

Transgenic :

외래 유전자를 식물 유전체에 통합하여 안정적으로 발현

한 번 유전자 삽입이 성공하면 지속적으로 생산 가능

농업적 규모의 대규모 생산 시스템과 호환

=> Transgenic N. benthamiana로 선정

# data[].attributes.body
재배 환경: biofarm

대규모 온실 시스템

온도, 습도, 빛의 강도 등을 엄격히 조절하여 안정적인 생장과 단백질 생산을 지원

수직 농장

공간 효율성을 극대화, LED 조명을 사용해 특정 파장의 빛을 제공하여 식물의 광합성과 단백질 발현을 촉진

# data[].attributes.body
photoperiod : 14h light/ 10h dark

humidity : 50-60%

temperature : 22-23 degree centigrade

# data[].attributes.body
단백질 수확량 증가

호르몬 처리

6-benzylaminopurine (BAP) 같은 성장 촉진제 사용하여 axillary stem(측아 줄기)의 생장 유도

axillary stem

N. benthamiana 에서 단백질 총 수확량의 50%를 기여

단백질 발현량이 높아 수율 극대화 가능

# data[].attributes.headline
우수 항암 유전자 후보의 확보

# data[].attributes.subject
우수 항암 유전자 후보의 확보

# data[].attributes.body
X 유전자가 우수 항암 유전자가 될 수 있다.

→ 선행 연구와 동일한 방식으로 이를 증명할 예정

→ S대학교와 K한방연구소 합동

# data[].attributes.body
IP (Immunoprecipitation)를 이용하면

X peptide의 pilot-scale 유용정제법을 확립할 수 있다.

-> SS 바이오에서 진행

# data[].attributes.body
X gene을 이미 SS바이오에서 가지고 있다.

# data[].attributes.body
선임의 선행연구에서 X 유전자를 사용하였으므로 이미 X 유전자를 가지고 있을 것이라 판단

# data[].attributes.body
X peptide/protein을 과발현 시킨 N. benthamiana를 1000평을 가득 메울 정도로 SS바이오에서 가지고 있다.

# data[].attributes.headline
이미  SS바이오에서는 식물공장을 가지고

# data[].attributes.body
이미 SS바이오에서는 식물공장을 가지고 있다.

# data[].attributes.body
: 대량 생산을 진행하기 전 테스트용으로 실제 생산 환경과 유사한 환경에서 진행하는 생산 규모를 의미 (상업화 전 단계)

# data[].attributes.body
실험 중 mutation, contamination, 기타 오류가 발생하지 않는다

# data[].attributes.body
면역침강법(Immunoprecipitation)

: 특정 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 용액에서 단백질 항원을 침전시키는 기술로, 수천개의 서로 다른 단백질을 포함하는 sample에서 특정 단백질을 분리, 농축 가능하다.

# data[].attributes.body
IP : 단순 면역침강법, single protein을 isolation 하기 위해 사용

Co-IP : Protein-Protein, Protein complex를 isolation 하기 위해 사용

ChIP : DNA-Protein의 상호작용을 분석하는 데 사용

RIP : RNA-Protein의 상호작용을 이용해 항원을 분리하는 데 사용

-> single protein을 정제하기 위함이므로 일반 IP를 사용

# data[].attributes.body
1. Protein sample lysis

2. Pre-clearing the lysates

​

3. Add antibody + protein beads

​

4. Centrifuge

​

5. wash and Elute

​

6. Purify

# data[].attributes.body
x peptide/protein는 protein으로 작용할 경우 더 강한 항암효과를 가진다.

# data[].attributes.body
이미 연구실에 선임 연구원이 발현, 정제 해놓은 X 단백질이 존재하므로 이 X를 보내주고 'BIONEER' 업체에 항체를 주문 제작할 예정

-> 이때 항체에 bead를 함께 붙여달라고 요청하여 따로 bead를 구매하지 않고 바로 사용할 예정

= antibody-bead conjugate

# data[].attributes.headline
연구에 필요한 실험실 기구는 모두 갖춰져

# data[].attributes.body
연구에 필요한 실험실 기구는 모두 갖춰져 있다.

# data[].attributes.body
형질전환한 Nicotiana benthamiana sample에서 단백질을 추출한다.

# data[].attributes.body
형질전환한 Nicotiana benthamiana sample

핀셋

액체질소

막자사발

tube

pipette

RIPA lysis buffer

# data[].attributes.body
식물 유래 항암 peptide/단백질 발견 및 안정적인 생산, 정제 기술 개발

# data[].attributes.body
우수 항암 유전자 후보의 확보

후보 항암 peptide/단백질의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템 개발

후보 항암 peptide/단백질의 pilot-scale 유용정제법 확립

# data[].attributes.body
1. 연구목표

2. 알고있는 것

3. 가정

4. 가설

5. 가설1 및 실험 설계

6. 가설2 및 실험 설계

7. 가설3 및 실험 설계

8. 결론

# data[].attributes.headline
우수 항암 유전자 후보의 확보

# data[].attributes.subject
우수 항암 유전자 후보의 확보

# data[].attributes.body
X 유전자가 우수 항암 유전자가 될 수 있다.

# data[].attributes.headline
후보 항암 peptide/protein의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템

# data[].attributes.subject
후보 항암 peptide/protein의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템

# data[].attributes.body
X peptide/protein를 효과적으로 대량 생산 하기 위한 방식은 식물 세포 배양 시스템을 이용한 방식일 것이다.

# data[].attributes.body
IP (Immunoprecipitation)를 이용하면

X peptide의 pilot-scale 유용정제법을 확립할 수 있다.

# data[].attributes.body
antibody-bead conjugate

protein lysate

magnetic rack

0.1 – 0.2 M Glycine, pH 2.6

Tris-HCl, pH 8.5

PBS

# data[].attributes.body
앞선 방법들을 통해 효과적으로 원하는 단백질을 대량 생산, 정제할 수 있을 것이라 예상됨

정제한 단백질은 vial에 나누어 담아 액상 또는 동결 건조형으로 안정한 상태로 보관할 예정

+ 자동 이물검사 시스템과 제한 접근시스템을 통해 품질 관리

-> 추가적으로 이를 활용하여 정제한 단백질을 이용한 항암제 개발까지 이어질 수 있을 것으로예상하며 이렇게 만든 바이오의약품으로 추가적인 부수입을 얻을 수 있을 것으로 예상됨