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Métodos de purificación y análisis de ácidos nucleicos.

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Métodos de purificación y análisis de ácidos nucleicos.

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Los métodos para purificar y analizar ácidos nucleicos incluyen:

Extracción

Para extraer ácidos nucleicos, se disgregan las células o tejidos, se inactivan las nucleasas y se separan los ácidos nucleicos de los demás componentes celulares.

Purificación

La purificación de ácidos nucleicos puede variar según el tipo de ácido nucleico que se quiera aislar, el grado de pureza requerido y si se usan sustancias tóxicas o inocuas.

Detección y cuantificación

Para detectar y cuantificar ácidos nucleicos se puede usar espectrofotometría UV y de fluorescencia.

Análisis

La pureza de un ácido nucleico se puede evaluar con espectrofotometría UV, electroforesis en gel o PCR cuantitativa.

Extracción de ADN y ARN :

Métodos basados ​​en disrupción celular : Uso de detergentes, enzimas o técnicas físicas (homogeneización, ultrasonido).

Purificación : Uso de fenol-cloroformo, columnas de sílice o kits comerciales.

Precipitación : Alcohol isopropílico o etanol, con sales como acetato de sodio.

Análisis de calidad:

Espectrofotometría UV : Medición a 260 nm para concentraciones de ácidos nucleicos.

Electroforesis en gel : Geles de agarosa o acrilamida para evaluar tamaño e integridad. (1)

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Imagen2: Hibridación in situ fluorescente

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Las técnicas de hibridación son procedimientos que se basan en la unión de dos moléculas complementarias de ADN o ARN para formar una molécula de doble cadena. Estas técnicas se utilizan en estudiar la expresión génica, y localizar genes en cromosomas.

Algunas de ellas son:

Southern blot : Detección de ADN específico.

Northern blot : Análisis de ARN mensajero (expresión génica).

FISH (Hibridación in situ fluorescente) : Identificación de secuencias específicas en cromosomas o tejidos, sondas fluorescente.

Tradicional: enzimas o isotopos radiactivos (2).

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Técnicas de clonación de genes (Tecnología del ADN recombinante)

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Técnicas de clonación de genes (Tecnología del ADN recombinante)

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El ADN recombinante (rADN) es una tecnología que utiliza enzimas para cortar y unir secuencias de ADN de interés. Las secuencias de ADN recombinado se pueden colocar en unos vehículos llamados vectores que transportan el ADN hacia el lugar adecuado de la célula huésped donde puede ser copiado o expresado.

Pasos clave :

Aislamiento de ADN de interés : Uso de enzimas de restricción.

Inserción en un vector : Plásmidos, fagos o BACs, empleando ligasas.

Transformación : Introducción del vector en un organismo huésped (E. coli, levaduras).

Selección y expresión : Uso de marcadores selectivos y análisis funcional del gen clonado (3).

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Las técnicas de secuenciación son métodos para determinar el orden de los nucleótidos en el ADN, lo que es importante para conocer la información genética y cómo se regula su expresión. Algunas técnicas de secuenciación son:

Sanger o terminación de la cadena

Es un método sencillo para secuenciar ADN, que se basa en la acción de las ADN polimerasas. Este método es preciso y reproducible, y se puede utilizar para secuenciar distintos tipos de ADN.

Secuenciación automática

Es otro método para secuenciar ADN.

Secuenciación de próxima generación (NGS)

Es una técnica que permite detectar alteraciones en los genes de las muestras de pacientes con cáncer.

Secuenciación química

Es un método que se originó para estudiar las interacciones entre ADN y proteínas (4)

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Prueba de PCR en el diagnóstico de enfermedades: Genéticas, por microorganismos. 

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Prueba de PCR en el diagnóstico de enfermedades: Genéticas, por microorganismos. 

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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica esencial en biología molecular utilizada para amplificar secuencias específicas de ADN, incluso en cantidades mínimas. Se ha convertido en una herramienta clave para:

Diagnóstico de enfermedades genéticas

La PCR permite identificar mutaciones específicas en genes asociados con enfermedades hereditarias.

Aplicaciones principales:

1. Detección de mutaciones puntuales:

2. Diagnóstico prenatal:

Detección de anomalías genéticas en el ADN.

3. Análisis de portadores:

Evaluación de mutaciones recesivas en parejas con riesgo de transmitir enfermedades.

Métodos específicos:

PCR convencional: Para detectar mutaciones conocidas.

PCR en tiempo real (qPCR): Cuantificación de copias de un gen anómalo.

PCR digital: Alta sensibilidad para mutaciones somáticas en el cáncer.

2. PCR en el diagnóstico de enfermedades causadas por microorganismos

La PCR es ampliamente utilizada para detectar infecciones bacterianas, virales, micóticas y parasitarias.

PCR convencional : Amplificación específica de fragmentos de ADN de patógenos.

PCR en tiempo real (qPCR) : Cuantificación de carga viral o bacteriana (ej. VIH, SARS-CoV-2).

RT-PCR : Conversión de ARN a ADNc para detectar virus de ARN (ej. influenza, dengue).

Ventajas : Alta sensibilidad, especificidad y rapidez.

Limitaciones : Requiere equipamiento especializado y controles estrictos para evitar la contaminación. (5)

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1. 1.1 EXTRACCIÓN y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS – :: BIOTED :: (s. f.). https://www.bioted.es/extraccion-y-purifcacion-de-acidos-nucleicos/

2. Hibridación. (s. f.). Genome.gov. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Hibridacion#:~:text=La%20hibridaci%C3%B3n%2C%20en%20relaci%C3%B3n%20con,mol%C3%A9culas%20de%20una%20sola%20hebra.

3. ADN recombinante (rADN). (s. f.). Genome.gov. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/ADN-recombinante-rADN#:~:text=El%20ADN%20recombinante%20(rADN)%20es,puede%20ser%20copiado%20o%20expresado.

4. Secuenciación. (2014b, marzo 13). Portal Académico del CCH. https://e1.portalacademico.cch.unam.mx/alumno/biologia1/unidad3/ingenieriagenetica/ADNrecombinante/secuenciacion#:~:text=Para%20la%20secuenciaci%C3%B3n%20de%20ADN,de%20nuevos%20fragmentos%20de%20ADN.

5. Pruebas de PCR. (s. f.). https://medlineplus.gov/spanish/pruebas-de-laboratorio/pruebas-de-pcr/#:~:text=Las%20pruebas%20de%20PCR%20son,de%20la%20propagaci%C3%B3n%20de%20enfermedades.