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2. Elementos necesarios para la reacción

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2. Elementos necesarios para la reacción

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3. Alcances y aplicaciones (un ejemplo utilizado en la producción de proteínas recombinantes o metabolitos)

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3. Alcances y aplicaciones (un ejemplo utilizado en la producción de proteínas recombinantes o metabolitos)

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4. Incluye un vector recombinante ensamblado con este método

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4. Incluye un vector recombinante ensamblado con este método

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5. Referencias de las fuentes consultadas

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5. Referencias de las fuentes consultadas

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4) Vector recombinante ensamblado con este método

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4) Vector recombinante ensamblado con este método

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El método puede combinar simultáneamente hasta 15 fragmentos de ADN según la identidad de secuencia. Requiere que los fragmentos de ADN contengan ~ 20-40 pares de bases superpuestos con fragmentos de ADN adyacentes. Estos fragmentos de ADN se mezclan con un cóctel de tres enzimas, junto con otros componentes tampón.

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La clonación mediante ligación y digestión de enzimas de restricción es una manera simple y fácil de mover un fragmento de ADN bicatenario de un plásmido a otro.

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En el Gibson Assembly Master Mix, se encuentran en un mismo buffer las 3 enzimas (Exonucleasa, Ligasa y Polimerasa) requeridas para llevar a cabo la reacción a una sola temperatura (isotérmica).  (50 °C por 15 min o hasta 1 hora dependiendo del número de fragmentos y eficiencia enzimática)

Al digerir los productos de PCR (Amplificados mediante primers específicos) que ya incluyen las secuencias sobrelapantes, después se ligan y se reparan con ayuda de la ligasa y la polimerasa para ser insertadas en el vector recombinante.
En resumen los elementos necesarios son:

Exonucleasa (T5 exonucleasa)

Polimerasa (Phusion DNA polimerasa)

Ligasa (Taq DNA ligasa)

Productos de PCR

Primers Gibson (para generar los fragmentos a insertar)

Vector Backbone

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Fue desarrollado para clonar múltiples fragmentos de DNA en paralelo de una manera estandarizada y usando la misma enzima. Este sistema esta basado en las reacciones específicas del bacteriófago λ dentro y fuera del genoma de E. coli.

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2) Elementos necesarios para la reacción

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2) Elementos necesarios para la reacción

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Es dependiente de dos cosas:

Depende de la habilidad de la enzima de restricción para "cortar" ambos fragmentos de ADN (fragmento y vector)

Requiere de la enzima ligasa para "pegar" el fragmento de ADN dentro del vector

Pasos:

1. Secuencias cortas que contienen sitios de restricción se adicionan a primers 5' durante la amplificación de ADN por PCR

2. El vector y el fragmento de ADN son digeridos con enzimas de restricción para crear extremos cohesivos

3. El vector y el fragmento de ADN son ligados

4. El ADN recombinante entra a la célula hospedera durante la transformación

(Goldbio, 2022)

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- Descripción de rutas metabólicas para bacteriófagos
- Mutagénesis de sitio directo

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ThermoFisher. (2020). Digestión de enzimas de restricción y modificación del ADN. Recuperado de: https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/cloning/restriction-enzyme-digestion-and-ligation.html

Zhang, K., Yin, X., Shi, K. et al. Un método de alta eficiencia para la mutagénesis dirigida al sitio de plásmidos grandes basado en la amplificación de fragmentos de ADN grandes y la ligadura recombinante. Informe científico 11 , 10454 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-89884-z

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Restriction Enzyme Digestion and Ligation | Thermo Fisher Scientific - US

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Overview of restriction enzyme and DNA modification products for restriction enzyme cloning

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Se necesita de:
• Vector donante
• Vector de entrada
• Vector destino
• Vector de expresión
• Clonasa LR y BP

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* Clonación de vectores
*Clonación recombinante
* Clonación multisitio
* Screening de expresión

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Proceso de clonación del LpGH en el vector pCR8 y como se da la recombinación entre este vector y el vector pMDC32 para integrar la secuencia del gen. 

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Caracterizar el DNAc de la hormona de crecimiento del Huachinango (LpGH) y producirlo empleando Pichia pastoris y Chlorella sorokiniana como sistemas para la obtención de proteínas recombinantes.

La region codificante de la proteína madura se insertó en el vector de clonación pMDC32 (vector destino). El vector pCR8 es el vector de entrada.

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Método que permite ensamblar de forma simultánea y direccional múltiples fragmentos de ADN en un vector.  Utiliza enzimas llS (Shifted cleavage), las cuales cortan fuera de las secuencias de reconocimiento.  Dicho corte con desplazamiento (ej: ie, Bsal, BsmBl, Espel), consta de 4 nucleótidos, generando extremos cohesivos.

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2. Elementos necesarios para la reacción

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2. Elementos necesarios para la reacción

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A) Plásmido de destino pGGAselect

B) Inserciones de ADN, las cuales deben estar flanqueadas en sus dos extremos por los sitios de restricción de la enzima IIS utilizada dentro de un backbone plásmidico.

C) Buffer de ADN ligasa T4

D) Enzima IIS (BsaI, BpiI o BsmBI)

E) Buffer optimizado para las enzimas IIS

F) H2O sin nucleasas

Una metodología convencional de Golden Gate inicia mezclando el vector principal, los insertos, la ligasa, la enzima IIS, el buuffer de ligación y el agua libre de nucleasas para posteriormente introducir la solución en un termociclador donde, si se uso BsaI o BsmBI, se realizan hasta 50 ciclos de 37°C por 2 min, 16°C por 5 min, 50°C for 5 min y 80°C por 10 min.

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The modified Gibson assembly method using SDM primers and added quality control steps. Flowchart of the method’s main steps.

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The modified Gibson assembly method using SDM primers and added quality control steps. Flowchart of the method’s main steps.

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La clonación TOPO es una técnica de un sólo paso que no utiliza enzimas de restricción ni ligasa, sino que inserta fragmentos de ADN en vectores linealizados mediante la topoisomerasa I. Esta enzima es extraída del virus Vaccinia, y funciona como una enzima de restricción y ligasa. Asimismo, se basa en la capacidad de la Adenina (A) y Timina (T) para hibridad y formar enlaces de hidrógeno (Swanson, 2016).

La topoisomerasa reconoce la secuencia y escinde en la secuencia  5′-(C/T)CCTTNNN-3′, se forma un enlace covalente entre la hebra de ADN 3’ escindida y un residuo de tirosilo de la topoisomerasa, y por otro lado un hidroxilo 5’ libre que puede ser atacado por una hebra de ADN, de esta manera uniendo las dos hebras de ADN y liberando la topoisomerasa (D’Arpa, 2009; Swanson, 2016).

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Vibrio natriegens es conocido como el organismo de crecimiento más rápido del mundo con un tiempo de duplicación de menos de 10 min, creando una potencial alternativa para el uso de este organismo en biología sintética, reemplazando a E. coli en muchas aplicaciones, hasta ahora no existía un conjunto de herramientas completo que contuviera partes bien caracterizadas y estandarizadas. La Colección Marburg supera el paradigma de la construcción de plásmidos (integrando insertos en una columna vertebral) al permitir el ensamblaje de novo de plásmidos a partir de partes genéticas básicas.Permitiendo a los usuarios seleccionar el origen de la replicación del plásmido y la parte de resistencia de forma independiente, lo que es muy ventajoso cuando se dispone de un conocimiento limitado sobre el comportamiento de esas partes en el organismo objetivo.

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2. Elementos necesarios para la reacción

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2. Elementos necesarios para la reacción

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1. Producto de PCR que ha sido amplificado con Taq polimerasa (A --> 3')
-->No sitios específicos en primers

2. Purificar producto de PCR

3. Plasmido TOPO linearizado con topoisomerasa I del virus vaccina (T --> 3')
--> Enzima reconoce 5'-(C/T)CCTT-3'

4. Cuando vector y el fragmento se alinean, se libera la topoisomerasa I para ligarlos

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Generating Single Cell–Derived Knockout Clones in Mammalian Cells with CRISPR/Cas9
- Comprobación de knockout
(Giuliano et al., 2019)

Selection and Characterization of HIV-1 with a Novel S68 Deletion in Reverse Transcriptase
-Secuenciación para detección de mutaciones
(Schinazi et al., 2011)

Many Paths to Many Clones: A Comparative Look at High-Throughput Cloning Methods
-"Captura" de marcos de lectura abiertos
(Marsischky & LaBaer, 2004)

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4. Vector Recombinante Ensamblado con Golden Gate 

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4. Vector Recombinante Ensamblado con Golden Gate 

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Se generó el diseño de un toolkit para la la regulación de CRISPR en Komagataeibacter
- Describe niveles de clonación: (1= generar biobricks sencillos listos con BsaI en vectores donadores) (2= combinación de diferentes unidades transcripcionales con BspiI en vectores destino) (3= combinación de diferentes conjuntos de estos vectores con BsaI)

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4. Vector recombinante ensamblado con este método

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4. Vector recombinante ensamblado con este método

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Introducción de genes ccdB para permitir la selección directa de colonias positivas transformadas.

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5. Referencias de las fuentes consultadas

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5. Referencias de las fuentes consultadas

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Giuliano, C. J., Lin, A., Girish, V., & Sheltzer, J. M. (2019). Generating Single Cell-Derived Knockout Clones in Mammalian Cells with CRISPR/Cas9. Current protocols in molecular biology, 128(1), e100. https://doi.org/10.1002/cpmb.100

Marsischky, G., & LaBaer, J. (2004). Many paths to many clones: a comparative look at high-throughput cloning methods. Genome research, 14(10b), 2020-2028.

Schinazi, R. F., Massud, I., Rapp, K. L., Cristiano, M., Detorio, M. A., Stanton, R. A., Bennett, M. A., Kierlin-Duncan, M., Lennerstrand, J., & Nettles, J. H. (2011). Selection and characterization of HIV-1 with a novel S68 deletion in reverse transcriptase. Antimicrobial agents and chemotherapy, 55(5), 2054–2060. https://doi.org/10.1128/AAC.01700-10

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Wang et al. (2018) utilizaron el método Golden Gate para construir un vector de intercambio alélico del gen eag, que codifica para la proteína EA1 de B. anthracis.
Los reemplazos de genes en B. anthracis requieren mucho tiempo y trabajo debido a la falta de un esquema de contraselección para hacer frente a la baja eficacia de la recombinación homóloga entre los plásmidos diana y el ADN cromosómico. Una alternativa a tales esquemas de contraselección implica el uso de la enzima de restricción dirigida codificada por intrones I-SceI, que puede escindir un sitio único introducido en un genoma; esta propiedad se ha explotado en la promoción de la recombinación homóloga.
La construcción de vectores de recombinación homóloga de B. anthracis se hace normalmente con enzimas de restricción. En el estudio se utilizó el método de clonación Golden Gate para construir un vector knockout en B. anthracis, lo que permitió una subclonación de un solo paso de alta eficiencia, sin la inclusión de ningún nucleótido adicional en el producto clonado final.
Ellos introdujeron un sitio I-SceI en el vector para elevar la eficacia de la recombinación homóloga entre el vector de intercambio alélico y el ADN cromosómico, y así, lograron eliminar el gen eag en B. anthracis.

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Alcances y aplicaciones (un ejemplo utilizado en la producción de proteínas recombinantes o metabolitos)

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Alcances y aplicaciones (un ejemplo utilizado en la producción de proteínas recombinantes o metabolitos)

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Este método ha sido ampliamente adoptado y es una herramienta muy importante en proyectos de biología sintética en todo el mundo. Tanto en experimentaciones in vivo como en in vitro. También se utiliza para las estrategias  de modificación de proteínas en la evolución dirigida y mutagénesis dirigida.

Hablando de las aplicaciones de esta metodología. Una de ellas fue el ensamblaje del genoma mitocondrial de ratón de 16,3 kb a partir de 600 60-meros superpuestos. Otra aplicación fue la en conjunto con el ensamblaje in vivo en levadura, se utilizó el ensamblaje Gibson para sintetizar el genoma de Mycoplasma mycoides de 1.1 Mbp. El genoma sintetizado fue trasplantado a una célula receptora de M. capricolum, creando nuevas células auto-replicantes de M. mycoides. (NEB, 2022)

Finalmente, otras aplicaciones han sido el ensamblaje Gibson para la Site-Directed Mutagenesis mediante primers SDM (Olszakier & Berlin, 2022)
y la creación de un vector recombinante con vectores linealizados con CRISPR/Cas9 (Wang et al., 2018).

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https://docs.google.com/presentation/d/1VRZ3A-8iZiLrYs7NivV_pThBrn0VnCQoENE-XL_Vr0w/edit?usp=sharing