# data[].attributes.body
Udarbejdet af Caroline, Emma, Johan, Miriam, Pernille og Stine
Avatar for Stine Kirk
Stine Kirk
 +  3
●

# data[].attributes.body
GFP er et protein, som er et protein der giver ultraviolet lys, hvis det bliver lyst på. En anden af vores DNA sekvenser er bla, som koder for et enzym, ampicillin resistens, og som har den evne at gøre bakterien modstandsdygtig overfor ampicillin. Bla bliver til et enzym, som bliver til betalactamase. Til sidst har vi ori, som sørger for at plasmidet befinder sig i bakterierne, fordi plasmidet kan replikere sig selv i bakterien.

# data[].attributes.body
De rekombinerede plasmider overføres til bakterier vha. en proces man kalder transformation. Først ligger bakterierne i en opløsning af calciumchlorid. Calcium-ionerne hjælper med at gøre bakteriernes cellemembran mere gennemtrængelig for DNA. Derefter blandes bakterierne med plasmider og blandingen udsættes for varmechok, som gør at bakterierne optager plasmider. Hvis transformationen lykkes har bakterierne fået nye egenskaber og kaldes transgene eller genmodificerede.

Når bakterierne vokser og deler sig fordeles plasmiderne tilfældigt og man ender med en samling genetisk ens bakterieceller, der hver især indeholder mange men et forskelligt antal plasmider. Opformering af bakterier kalder man for kloning uanset om bakterien er almindelig eller transgen.

Selektivt markørgen.

Når man dyrker bakterierne på et vækstmedium tilsat ampicillin, vil kun de bakterier som har optaget et eller flere plasmider, overleve - der sker altså en selektion. Resistensgenets funktion er således at være markør for om transformationen med plasmider er lykkedes. I vores Pglo forsøg fungerer lacZ-genet som et selektivt markørgen.

# data[].attributes.body
De tre muligheder ved gensplejsning

# data[].attributes.body
araC-genet koder for proteinet ARAC, der er en transkriptionsfaktor. ARAC binder sukkerstoffet arabinose, hvorved transkriptionsfaktoren bliver aktiv og binder til en særlig promoter, der er placeret foran GFP-genet.

Forklar hvad en promoter og en transkriptionsfaktor er?

En promoter kaldes også for en “initiativtager”. Promotoren sidder på DNA’et lige før genet og det er her, transskriptionsfaktoren binder sig, således RNA-polymerasen kan ske i transskriptionsfasen. Det er polymerasen, der adskiller de to DNA-strenge, så frie RNA nukleotider kan tiltrækkes og baseparres med DNA’et. De frie nukleotider er adenin, cytosin, guanin og uracil, hvor uracil er den eneste base, der er forskellig fra de andre DNA-nukleotider - den kan baseparres med adenin. De komplementære nukleotider bliver vha. RNA-polymerasen tilføjet til skabelon-DNA-strengen. Når polymerasen standses og transskriptionen stopper, er resultatet en ny fritliggende RNA-kæde i cellekernen (mRNA), der gennem porer i cellekernen kan vandre ud i cytoplasma. Denne skal så yderligere videre til næste fase, der er translationen - til sidst opnås proteinsyntesen, der styrer hele genreguleringen. For at alt dette kan foregå, skal der altså være en promoter til stede, som sætter det hele i gang.

Transskriptionsfaktoren er med til at regulere, hvor hurtigt eller langsomt polymerasen skal arbejde - specielle transkriptionsfaktorer kan blandt andet være enhancer (fremmende) eller silencer (hæmmende).

Giv med udgangspunkt heri en forklaring på, hvorfor bakterierne kun er grønne under UV lys, når der er arabinose til stede i vækstmediet?

Genet araC på DNA sekvensen kan aktiveres, når arabinose er til stede, og når det aktiveres har det den funktion, at den yderligere kan aktivere transskriptionen af DNA sekvensen GFP. GFP er et protein, der giver en lysende grøn farve under UV-lys - araC er altså et regulator-gen og arabinose er den sukkerart som man tilsætter agar-pladen, som kan aktivere araC-genet. Når arabinose er til stede på agarpladen kan regulator-genet araC aktiveres, således at GFP yderligere bliver aktiveres - dette giver den grønne farve på bakterierne under UV-lys.

# data[].attributes.body
Angiv, hvad de fire plader indeholder, og forklar hvilke plader, I vil forvente at se bakterievækst på?

Vores første agarplade (figur 1.1) havde vi vækstmediet LB tilstede. Her er det kun vores bakterier der vil kunne vokse, men baktierkoloninerne vokser meget, at der dannes en såkaldt “bacterial-lawn” - dette tykke lag af bakterier har nemlig de helt rette forhold for at vokse, fordi der kun er vækstmediet LB tilstede.

Vores anden agarplade (figur 1.2) har vi vækstmediet LB til stede, ampicillin og intet DNA. Her er der ingen bakterier, da de ikke har mulighed for at vokse, når ampicillin er tilstede og der er manglende DNA, der skulle have dannet resistens mod ampicillinen - da de ikke har det, vil bakterierne dø. Her forventede vi dermed ikke at se bakterievækst.

Den tredje agarplade (figur 1.3) indeholder vækstmedie og ampicillin + DNA ( pGLO plasmid). Her forventes der en almindelig bakterievækst, i og med at DNA er til stede, vil der udvikles resistens overfor ampicillin.

Den fjerde agarplade (figur 1.4) indeholder vækstmediet LB, arabinose, ampicillin og pGLO plasmidet. Her kunne bakterierne lyse grønt under det ultraviolette lys, da den indeholder arabinose. Da det kun er her den lyser grøn, kan vi sige, at den skal indeholde alle disse komponenter, for at bakterierne under UV-lys kan lyse grønne.

Gør udførligt rede for, hvad pladerne –eller kombinationer af pladerne- kan fortælle?

Vækstmediet er til stede for at bakterierne kan vokse under de samme omstændigheder. Ampicillin (antibiotika) bruges til at se, om bakterierne har dannet resistens overfor dette stof - hvis ikke bakterierne har dannet dette, vil de dø. Arabinose bruges til at danne mRNA, da vores RNA polymerase kan bindes, og så vil transskriptionen kunne finde sted. Vores pGLO plasmid skal også være til stede, da det er dette plasmid der indeholder genet for “at lyse”.

Kombinationerne af pladerne viser, hvordan de transgene bakterier reagerer på de forskellige stoffer, der er til stede.

1. LB og ingen DNA: bakterierne overlever og danner "bacterial lawn"
2. LB, Amp og ingen DNA: ingen bakterievækst grundet manglende DNA og derfor ingen resistens overfor antibiotikaen
3. LB, Amp og DNA: Almindelig bakterievækst, da der er DNA til stede og dermed resistens overfor antibiotikaen
4. LB, Amp, DNA og Arabinose: Almindelig bakterievækst og grøn farve under UV-lys grundet

# data[].attributes.body
Beskriv kort, hvad pGLO plasmidet indeholder, og hvordan plasmidet kan indsættes i en bakterie

pGLO-plasmidet indeholder genet for GFP (Grønt Fluorescerende Protein), samt resistensgenet mod antibiotikaet ampicillin. Derudover indeholder det et specielt system af regulerings-gener, som kan bruges til at styre udtrykket af det fluorescerende protein i de transformerede celler. Dette gen, GFP, kan på enkel vis tændes og slukkes ved tilførsel af sukkerstoffet arabinose til næringssubstratet.

Plasmidet kan indsættes i en bakterie ved genetisk transformation, som er et princip hvor man kan transformere bakterier med gener, så de tilføres en ny egenskab, f.eks. resistens for antibiotika. For at plasmidet kan indsættes i en bakterie, overføres bakterierne fra en agarplade til en opløsning med CaCl_2, som står i et isbad. CaCl_2 gør cellemembranen mere permeable, så plasmidet nemmere kan trænge igennem.
Når plasmidet har fået indsplejset donorgenet (GFP), tilsættes disse til CaCl_2 opløsningen. Via et varmechok i 2 min. ved 42°, optager nogle af bakterierne de rekombinerede plasmider, hvorved det transformeres.

Grunden til at plasmidet indeholder genet er, at et restriktionsenzym har klippet det ønskede gen, GFP, ud fra det samlede gen, hvorved vi får muligheden for at tilføje netop dette gen til en bakterie. Dette gen indsættes i et plasmid, som et andet restriktionsenzym har klippet op netop der hvor baseparrene matcher det opklippede gen, så de to ‘sticky ends’ kan sættes sammen. Idet både DNA’et og plasmidet er åbent, findes der tre mulige udfald.

1. Plasmidet lukkes igen uden at have optaget det ønskede gen

2. Genet lukkes igen uden at være blevet optaget af plasmidet

3. Plasmidet optager det ønskede gen hvorved der dannes et plasmid med det indsplejsede gen.
Se figur 1.

Måden hvorpå plasmidet og genets ‘sticky ends’ sættes sammen, sker via DNA-ligase, der fungerer som en slags lim.