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La electroforesis es una técnica utilizada para separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica. Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través de un gel. Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes. Las condiciones utilizadas durante la electroforesis se pueden ajustar para separar moléculas en el rango de tamaño que se desee.

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La herramienta que utilizamos para encontrar información sobre alguna amiba

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La herramienta que utilizamos para encontrar información sobre alguna amiba

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https://amoebadb.org/amoeba/app

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Herramienta para buscar información de interés de distintos organismos

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Herramienta para buscar información de interés de distintos organismos

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

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A portal to gene-specific content based on NCBI’s RefSeq project, information from model organism databases, and links to other resources.<br />

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https://www.youtube.com/watch?v=TIZRGt3YAug

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Herramienta para revisar que el inserto no tenga sitios de corte de enzima de restricción

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Herramienta para revisar que el inserto no tenga sitios de corte de enzima de restricción

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Para poder checar que el inserto no tenga sitios de corte de enzima de restricción usamos la siguiente herramienta bioinformática

http://nc2.neb.com/NEBcutter2/

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Esta herramienta tomará una secuencia de ADN y encontrará los marcos de lectura abiertos grandes que no se superponen utilizando el código genético de E. coli y los sitios para todas las enzimas de restricción Tipo II y Tipo III disponibles comercialmente que cortan la secuencia solo una vez. De forma predeterminada, solo se utilizan las enzimas disponibles de NEB, pero se pueden elegir otros conjuntos. Simplemente ingrese su secuencia y "envíe". Aparecerán más opciones con la salida. El tamaño máximo del archivo de entrada es de 1 MByte y la longitud máxima de la secuencia es de 300 KBases.

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Esta herramienta nos servirá para poder diseñar de oligonucleótidos los cuales amplificarán una región o gen mediante enzimas de restricción, es necesario agregar los sitios de corte en la secuencia del oligonucleótido diseñado, es por eso que la siguiente herramienta se trata de esto

https://international.neb.com/-/media/nebus/files/chart-image/cleavage_olignucleotides_old.pdf?rev=c2f94e1cdcd549c5bf8fdb59f7b63f67&hash=0C83C8F3C59132BE6A5B9A6D4050E3A0

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Esta herramienta es útil para el diseño de los oligonucleótidos para amplificar por PCR.

https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

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Esta herramienta es útil para el diseño de los oligonucleótidos para amplificar por PCR.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

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The .gov means it's official.
Federal government websites often end in .gov or .mil. Before sharing sensitive information, make sure you're on a federal government site.

The site is secure.
The https:// ensures that you are connecting to the official website and that any information you provide is encrypted and transmitted securely.

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The .gov means it's official. Federal government websites often end in .gov or .mil. Before sharing sensitive information, make sure you're on a federal government site. The site is secure. The https:// ensures that you are connecting to the official website and that any information you provide is encrypted and transmitted securely.

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Herramienta para checar cuantas bases adicionales hay que agregar a la enzima

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Herramienta para checar cuantas bases adicionales hay que agregar a la enzima

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Como vimos anteriormente además de incluir el sitio de corte es fundamental agregar algunas bases para que la enzima de restricción corte adecuadamente, pues bien cada enzima de restricción tiene un requerimiento específico para que se mejore la eficiencia de corte

https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments

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Annealed 5´ FAM labeled oligos were incubated with the indicated enzyme (10 units/ 1pmol oligo) for 60 minutes at the recommended incubation temperature and NEBuffer. The digest was run on a TBE acrylamide gel and analyzed by fluorescent imaging. The double stranded oligos were designed to have the indicated number of base pairs from the end followed by the recognition sequence and an additional 12 bases. In some cases asymmetric cleavage was observed and interpreted as a negative result. Asymmetric cleavage decreased with increasing base pairs from the end.

Note: As a general rule and for enzymes not listed below, 6 base pairs should be added on on either side of the recognition site to cleave efficiently. The extra bases should be chosen so that palindromes and primer dimers are not formed. In most cases there is no requirement for specific bases.

Note: You may download the previous tables, which use a different methodology here:
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) and
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector)

# data[].attributes.attachment_link.title
Cleavage Close to the End of DNA Fragments

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Annealed 5´ FAM labeled oligos were incubated with the indicated enzyme (10 units/ 1pmol oligo) for 60 minutes at the recommended incubation temperature and NEBuffer. The digest was run on a TBE acrylamide gel and analyzed by fluorescent imaging.

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Para saber cual buffer utilizar y para realizar una doble restricción se usa esta herramienta

https://nebcloner.neb.com/#!/redigest

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Con esta herramienta nos ayudará a poder obtener Tm de los oligonucleótidos y calcular la temperatura de alineamiento.

https://www.thermofisher.com/mx/es/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html

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How to use the T m calculator

The calculator calculates recommended T m (melting temperature) of primers and PCR annealing temperature based on the primer pair sequence, primer concentration, and DNA polymerase used in PCR. The calculator also calculates the primer length, percentage of GC content, molecular weight, and extinction coefficient.

The modified Allawi & SantaLucia's thermodynamics method [1] is used for T m and annealing temperature calculation of reactions with Platinum SuperFi, Phusion and Phire DNA Polymerases. The parameters were adjusted on a set of primers seeking to maximize specificity and retain high yields.

To use this calculator select your DNA polymerase, type in or paste your primer sequences, and provide your final primer concentration. T m values, annealing temperature, and other data are automatically generated.

If necessary, use a temperature gradient to further optimize and empirically determine the ideal annealing temperature for each template-primer pair combination. The annealing temperature gradient should start with temperature 6-10 °C lower than annealing temperature generated by the calculator and increased up to the extension temperature ( two-step PCR).

Allawi, H. T., and SantaLucia, J. (1997). Thermodynamics and NMR of internal G-T mismatches in DNA. Biochemistry, 36(34), 10581-10594.

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Tm Calculator | Thermo Fisher Scientific - US

# data[].attributes.attachment_link.description
Application calculates the Tm of primers and estimates an appropriate annealing temperature when using different DNA polymerases

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¿Cómo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes fuentes? 

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¿Cómo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes fuentes? 

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Un método habitual utiliza dos tipos de enzimas: Enzimas de restricción y ADN ligasa.

Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco específica y corta el ADN en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar, muchas enzimas de restricción producen extremos de cadena sencilla cortos que sobresalen. Si dos moléculas tienen extremos sobresalientes que se empatan, pueden complementar sus bases y unirse. Sin embargo, no se combinan para formar una molécula de ADN completa hasta que la ADN ligasa las une sellando los espacios en el esqueleto del ADN.

Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen en un plásmido. Con ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente elegida, se realiza lo siguiente:

El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.

El fragmento del gen , que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.

Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar un plásmido recombinante que contenga el gen.

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son también llamados iniciadores o cebadores (primers): El diseño cuidadoso de primers es uno de los aspectos más importantes de la PCR. Primers mal diseñados pueden amplificar otros fragmentos de ADN distintos a los buscados.
Hay paginas especificas que podemos utilizar para nuestros diseños como son PRIMER3PLUS y PRIMER DESIGNING TOOL

para esto existen dos pasos básicos:
1) Necesitamos tener un fragmento que nos permita decir si en una colección de variedades este gen está presente.

2) Necesitamos obtener toda la secuencia codificante para clonarla en un plásmido.

A continuación, cuando hayamos elegido la secuencia que queremos  amplificar, vamos a cualquiera de los 2 programas  e introducimos la secuencia en la ventana principal ahí podemos elegir propiedades que nos  interesen en nuestros primers.
para finalizar ahí nos va a dar los mejores primers que haya podido encontrar.

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Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol.
Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse

En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales:
1. Homogeneización del tejido(consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético.)
2. Lisis celular (Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen.
Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN.)
3. Separación de proteínas y lípidos(En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación.)
4. Precipitación del ADN
5. Redisolución del ADN

A partir de los años 90 se introdujeron al mercado kits de extracción que utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas positivamente capaces de retener varios microgramos de DNA y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores.
Los Kits se venden en presentación de membranas de sílice o perlas magnéticas

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El NanoDrop One es un espectrofotómetro UV-VIS de barrido espectral que mide la variación de la absorbancia con la longitud de onda empleando solo una micro-gota. Pemite la medición rápida, fiable y reproducible de pureza de DNA, RNA y proteínas en volúmenes de microlitro, mostrando todo el espectro para detectar impurezas.

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Es un proceso de cíclico y requiere:

Dos cebadores. Secuencias cortas de ADN empleadas como molde para la síntesis de una nueva cadena.

Una ADN polimerasa termoestable. La más utilizada es la Taq

Nucleótidos de ADN. Son las cuatro bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina o Timina unidas a un grupo fosfato y a la desoxirribosa; que en su conjunto conforman la molécula de ADN.

Secuencia de ADN que queremos amplificar.

*1° Desnaturalización

El ADN duplex es separado en cadenas simples cuando la temperatura a la que se somete es de 94° C.

*2° Hibridación

Cebadores cortos de ADN (de 15 a 20 pares de bases) se agregan a la mezcla para  provocar que se unan mediante puentes de hidrógeno a las cadenas individuales de ADN a 54° C.

3° Síntesis

Se agrega ADN polimerasa que cataliza la producción de cadenas nuevas complementarias en dirección 5´→ 3´. La replicación ocurre cuando  la temperatura desciende a 72° C.

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Debido a que la transformación usualmente produce una mezcla de inusuales transformaciones y abundantes células no transformadas, es necesario este método para identificar las células que han adquirido el plásmido. Los plásmidos utilizados usualmente contienen un gen que les otorgue resistencia a un antibiótico. La cepa bacteriana a transformar, debe ser sensible a este.

Las células capaces de crecer en un medio de cultivo con este antibiótico, serán las que han sido transformadas por el plásmido, y las células que no puedan crecer carecerán de este.

# data[].attributes.body
Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de que fluórese cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN.

# data[].attributes.body
Una colonia que contenga el plásmido adecuado se deja crecer a mayor escala y se utiliza para producir proteína o plásmido. Debe tenerse en cuenta diferentes factores:

- Inoculación. Se debe partir de una única colonia de cultivo en medio selectivo sólido crecidas el día anterior. La incubación debe ser de 12-16 h coincidiendo con la transición de la fase logarítmica a la estacionaria.

- Medios de cultivo. Suelen ser líquidos y con suplemento antibiótico para lograr amplificar las células que portan el plásmido. El más utilizado es el medio Luria Bertani (LB), siendo la formulación que contiene 10 g de NaCl/L la que mejores rendimientos de ADN plasmídico ofrece.

- Volumen de cultivo. Casi todos los métodos, muchos de ellos comerciales (sistemas miniprep), pueden adaptarse para diferentes volúmenes. En general se debe aumentar el volumen en función del tamaño y número de copias

- Cepas hospedadoras. La extracción de plásmidos se puede realizar a partir de las cepas salvajes que los albergan o de los transconjugantes a los que previamente se ha transferido el plásmido. En este último caso, se deben utilizar cepas receptoras conocidas para asegurarnos una extracción óptima.

# data[].attributes.body
La función de las ligasas utilizadas en la clonación de ADN  es unir fragmentos de ADN recién sintetizados para formar una cadena continua. Si dos fragmentos de ADN tienen extremos complementarios, la ADN ligasa puede unirlos para formar una molécula sin interrupciones.

Mediante el uso de ATP como fuente de energía, la ligasa cataliza una reacción en la que el grupo fosfato del extremo 5' de una cadena de ADN se une al grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra cadena.

# data[].attributes.body
Para este procedimiento las longitudes de los fragmentos se pueden determinar por electroforesis en gel. En algunas circunstancias se necesitan usar ADN plasmídico de diferentes fuentes para generar un ADN recombinante específico.
Los componentes relevantes en los plásmidos son el gen, el promotor, el gen de resistencia y el activador. En la clonación del gen,  dos enzimas de restricción  se utilizan para cortar el plásmido en el que el gen será insertado y para aislar el gen del segundo plásmido. El uso de dos enzimas de restricción diferentes tiene varias ventajas: permite que el gen insertado se oriente en la posición correcta para transcribir el “sentido” de la cadena de ADN (la cadena que codifica la proteína) y evita que el plásmido vuelva a formar el círculo sin el gen insertado.

# data[].attributes.body
Todas las bacterias que forman colonias deberían contener un plásmido. Sin embargo, no necesariamente es el caso que todas las colonias que contienen plásmidos tendrán el mismo plásmido.

Al cortar y pegar ADN, es posible la formación de productos secundarios, puede haber casos donde el plásmido se cierra en su forma original o casos donde el gen está en dirección inversa.

Debido a estas posibilidades, es importante recolectar ADN plasmídico de cada colonia y comprobar si coincide con el plásmido que intentábamos construir. Para analizar el ADN plasmídico de colonias bacterianas, se utiliza digestión con enzimas de restricción, PCR y secuenciación de ADN

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Para el diseño de oligonucleótidos los cuales amplificarán una región o gen mediante enzimas de restricción, es necesario agregar los sitios de corte en la secuencia del oligonucleótido diseñado. Para ello además de incluir el sitio de corte es necesario agregar algunas bases para que la enzima de restricción corte adecuadamente. Cada enzima de restricción tiene un requerimiento específico para que se mejore la eficiencia de corte.
Existen sitios donde se puede checar eso cómo son :

International.neb.com
También existen otros portales como son NEBcutter V2.0
Con esta herramienta podemos verificar los sitios de corte para enzimas de restricción de un inserto o un plásmido, solo tienes que obtener y copiar la secuencia de una base de datos y colocarla en el ventana del programa.

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Los tamaños de los fragmentos de ADN se pueden determinar al compararlos con una Escalera de ADN, una mezcla de fragmentos de ADN con tamaños conocidos. La escalera de ADN se carga adyacente a otras muestras de ADN para facilitar la comparación de las bandas de las muestras con las bandas de la escalera. Los resultados de la electroforesis en gel proporcionarán evidencia de que está utilizando el plásmido recombinante que contiene el gen de interés. El mismo procedimiento se usaría para verificar que un plásmido recombinante.