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Todo investigador que trabaje con moléculas de ADN conoce esta técnica. Y es que la PCR es una técnica imprescindible en múltiples ámbitos. Por ejemplo, en investigación bioquímica y médica, la PCR permite preparar fragmentos de ADN para su clonación en plásmidos bacterianos o virus para utilizarlos como vectores, paso imprescindible en el desarrollo de terapias génicas. Además, en Medicina, esta técnica es utilizada para diagnosticar enfermedades hereditarias. ¡Incluso se utiliza para identificar patógenos!

Por si fuera poco, la PCR es una técnica importantísima en las pruebas de paternidad y en los análisis forenses de la policía científica.

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LEI | Detección de Mycoplasma por PCR punto final

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Material

Micropipetas

Puntas para PCR

Autoclave

Tubos para PCR

Gradilla para tubos de PCR

Termociclador

Reactivos

Buffer de Reacción Taq 10X

dNTPs

Primers

ADN estándar

Agua libre de Nucleasas

Taq Polimerasa

Procedimiento
NOTA: Antes de comensar es recomendable preparar la reacción sobre hielo y precalentar el termociclador a 95 ° C. Todos los materiales deben estar esteriles (autoclave) y limpios.

Prepare los tubos que habrá de utilizar para su PCR en una gradilla. NOTA: Preferentemente NO etiquete la tapa del tubo ya que se puede borrar, mejora etiquete en los costados.

Realice los cálculos de para preparar las reacciones necesarias.

Coloque en cada tubo los primers que ha de usar como el de la secuencia problema y control de carga ej.: B-actina, GAPDH, betaína, etc.

Agregue cada componente de la tabla 1 en orden descendente en un tubo y marque el tubo como MasterMix. NOTA: coloque la polimerasa al final. Saque del congelador la enzima y regresela inmediatamente después.

Coloque una cantidad proporcional en cada tubo y pongola en el termociclador (figura 1) ya programado con las condiciones de la PCR (ver tablas abajo).

Al terminar su PCR analice su producto en un gel de agarosa.

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Sensibilidad de la PCR : se ha demostrado que el ensayo PCRMPB70 incrustado en tejido fresco tiene  buena sensibilidad y especificidad; por lo tanto, tiene el potencial de usarse como una prueba  rápida adicional para el diagnóstico de la tuberculosis bovina. La rapidez del diagnóstico es importante en al menos dos situaciones: cuando los productores están a la espera de los resultados para enviar las canales retenidas al matadero o cuando el productor y el veterinario oficial deben decidir aplicar una medida de  cuarentena definitiva o liberar una precaución de cuarentena, o  aplicar pruebas adicionales  en bandadas sospechosas; todos los casos, donde PCRMPB70 es una buena alternativa. 

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Sensibilidad de la PCR : se ha demostrado que el ensayo PCRMPB70 incrustado en tejido fresco tiene  buena sensibilidad y especificidad; por lo tanto, tiene el potencial de usarse como una prueba  rápida adicional para el diagnóstico de la tuberculosis bovina. La rapidez del diagnóstico es importante en al menos dos situaciones: cuando los productores están a la espera de los resultados para enviar las canales retenidas al matadero o cuando el productor y el veterinario oficial deben decidir aplicar una medida de  cuarentena definitiva o liberar una precaución de cuarentena, o  aplicar pruebas adicionales  en bandadas sospechosas; todos los casos, donde PCRMPB70 es una buena alternativa. 

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La especifidad de la PCR: la especificidad de la prueba de PCR que utiliza la secuencia IS6110 como blanco fueron bajas. Esto pudo ser debido al tamaño del fragmento de la PCR inicial amplificado por la PCR anidada. Para MPB70, el producto de la PCR fue de 372 pb, mientras que para la IS6110 fue de 583 pb. Aunque ambos productos son muy grandes para diagnóstico por PCR, el producto de la IS6110 es mayor por aproximadamente 200 pb; para la PCR anidada, la amplificación inicial de los productos generalmente ocurren previo a la expansión exponencial. De este modo, si hay un efecto grande de dilución debido a la gran cantidad de ADN del animal en el ambiente, es posible que los ciclos iniciales de la reacción de la PCR sean muy ineficientes, llevando a resultados falsos negativos. En este caso, se requiere trabajo de laboratorio adicional para aumentar la efectividad del método.

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La especifidad de la PCR: la especificidad de la prueba de PCR que utiliza la secuencia IS6110 como blanco fueron bajas. Esto pudo ser debido al tamaño del fragmento de la PCR inicial amplificado por la PCR anidada. Para MPB70, el producto de la PCR fue de 372 pb, mientras que para la IS6110 fue de 583 pb. Aunque ambos productos son muy grandes para diagnóstico por PCR, el producto de la IS6110 es mayor por aproximadamente 200 pb; para la PCR anidada, la amplificación inicial de los productos generalmente ocurren previo a la expansión exponencial. De este modo, si hay un efecto grande de dilución debido a la gran cantidad de ADN del animal en el ambiente, es posible que los ciclos iniciales de la reacción de la PCR sean muy ineficientes, llevando a resultados falsos negativos. En este caso, se requiere trabajo de laboratorio adicional para aumentar la efectividad del método.

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Eficiencia de PCR: La tasa de fallo de las pruebas PCR para detectar coronavirus es de unos 20 casos. Sin embargo, estos errores, que se consideran falsos negativos, dependen de una serie de factores, entre ellos, cómo se recogió la muestra y, sobre todo, el tiempo transcurrido desde la exposición inicial al coronavirus hasta que se tomó la PCR.

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Eficiencia de PCR: La tasa de fallo de las pruebas PCR para detectar coronavirus es de unos 20 casos. Sin embargo, estos errores, que se consideran falsos negativos, dependen de una serie de factores, entre ellos, cómo se recogió la muestra y, sobre todo, el tiempo transcurrido desde la exposición inicial al coronavirus hasta que se tomó la PCR.

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Fidelidad de la prueba de PCR
Diversos estudios han demostrado que la especificidad, el rendimiento y la fidelidad de la PCR se encuentra directamente influenciada por los diversos componentes que integran la técnica:
1. La mezcla de reacción
2. Región de reciclaje
3. ADN polimerasa
Resulta necesario planificar en cada caso una metodología en la que pueda existir un equilibrio entre estos parámetros, ya que desafortunadamente al ajustar algunas condiciones de la reacción para lograr la mayor especificidad no siempre es compatible con un alto rendimiento, y tratar de optimizar la fidelidad pudiera reducir la eficiencia.

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Ventajas de la PCR

Tiene una alta especificidad

Posee una alta sensibilidad

Se requiere poca muestra

Amplio rango dinámico

Se Monitorea todo el procedimiento

Transcripción reversa

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Desventajas de la PCR

Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.

Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN .

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro).