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A asparaginase é uma enzima hidrolase classificada como EC 3.5.1.1 e conhecida sistematicamente como L-asparagina amidohidrolase, catalisando a reação que converte L-asparagina em L-aspartato e amônia. Também é referida por nomes como colaspase, crisantaspase, elspar e leunase, e pode ser encontrada em diversos organismos, incluindo bactérias, fungos, plantas e animais, embora as formas clinicamente mais utilizadas sejam derivadas de bactérias como Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi (atualmente Dickeya dadantii). Na área médica, sua aplicação se destaca no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), uma vez que essa enzima depleta o aminoácido asparagina do meio extracelular, sendo que as células tumorais apresentam baixa capacidade de sintetizá-lo e, assim, sofrem comprometimento na síntese proteica e eventual morte, preservando as células normais. Adicionalmente, a asparaginase encontra uso na indústria alimentícia para reduzir a formação de acrilamida, um composto potencialmente carcinogênico que se forma durante o cozimento de alimentos ricos em carboidratos, contribuindo para a produção de alimentos mais seguros sem comprometer suas propriedades sensoriais. Dessa forma, a escolha por essa enzima se justifica por sua alta especificidade e eficácia tanto no combate a células tumorais quanto na melhoria da qualidade de produtos alimentícios.

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Aplicação da enzima escolhida: detalhamento do processo

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Aplicação da enzima escolhida: detalhamento do processo

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A asparginase é uma enzima cuja fução é quebrar a asparagina em aspartato e amônia. Algumas de suas formulação são as seguintes:

L-asparginase (derivada da E. coli)

PEG asparginase - asparginase peguilada de longa duração

Erwinina asparginase - que é usada quando há reação alergina as forma derivadas da E. coli.

A asparagina pode ajudar no tratamento de leucemia linfoblástica aguda (LLA) utilizando de um princípio metabólico seletivo onde as células leucêmicas dependem da asparagina para sobreviverem. Nesse caso, a asparginase catalisa a conversão da asparagina em ácida aspártico e amônia. As células cancerosas possuem uma deficiência na síntese de asparagina ou até uma ausência dessa capacidade. Dessa forma, cria-se um ambiente hostil para os linfoblastos que dependem da asparagina circulante no plasma sanguíneo para manter suas funções vitais. Como consequência ocorre a interrupção da síntese de proteínas essenciais nas células leucêmicas, levando a apoptose. Esses mecanismos atua seletivamente sobre as células malignas, poupando em grande parte as células saudáveis.

No tratamento convencional a asparginase é introduzida nas fases iniciais da quimioterapia, como na indução, para atingir a remissão completa da doença. E pode ser continuada na fase da consolidação com o objetivo de erradicar possíveis clones leucêmicos residuais. A via de aplicação pode ser intravenosa ou intramuscular a depender do tipo de asparginase a ser utilizada.

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A L-asparagina amidohidrolase tem destaque na área farmacêutica e alimentícia, sendo amplamente estudada e produzida para a formulação de biofármacos ou como agente de mitigação da acrilamida.

Na indústria, sua produção em larga escala se baseia no uso da biotecnologia em biorreatores, entretanto, apresenta baixo rendimento e problemas de imunogenicidade no organismo humano.

A produção de L-asparaginase (L-ASNase) pode ocorrer por diferentes microrganismos, sendo que a forma extracelular da enzima é preferível por facilitar o processo de purificação. Diversos gêneros de fungos, como Fusarium, Aspergillus e Penicillium, têm sido amplamente relatados como produtores extracelulares de L-ASNase. Além deles, várias leveduras, incluindo Saccharomyces, Candida, Pichia, Rhodotorula, Rhodosporidium e Trichoderma, também demonstraram capacidade de produzir essa enzima.

Com bactérias também é possível, sendo as principais: Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi; No entanto, geralmente apresentam produção intracelular, o que é menos preferível.

Em sua maioria, os microrganismos passam por etapas de melhoramento genético a partir de inserção de vetores moleculares contendo o gene que promove a expressão da enzima. Após, esses organismos são então cultivados em biorreatores sob condições otimizadas de fermentação, permitindo a produção de L-ASNase.

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As metodologias de extração e purificação mudam conforme o microrganismo utilizado. Alguns exemplos de metodologias para alguns microrganismos são:

1° Fungo Penicillium sp.: Após o período de incubação, a biomassa fúngica é coletada, pesada e macerada em tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 8,5) na proporção de 1:5 (massa:volume), utilizando agitação/trituração controlada para liberar o conteúdo intracelular e obter o extrato bruto enzimático. Esse extrato é então purificado em etapas sucessivas, incluindo precipitação com sulfato de amônio (80%), cromatografia líquida de filtração em gel Sephadex G-100 e cromatografia de troca iônica com DEAE-celulose;

2° Levedura Streptomyces albidoflavus: A biomassa celular é coletada, ressuspendida em tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4) e submetida à rompimento celular por homogeneização, sendo o extrato bruto obtido por filtração. A atividade da L-asparaginase foi determinada pela liberação de amônia em reação com L-asparagina, quantificada por nesslerização. A extração enzimática é otimizada com agentes como EDTA e lisozima, que aumentam significativamente a liberação da enzima intracelular, e a purificação foi realizada por precipitação com sulfato de amônio (80%), diálise e cromatografia em Sephadex G-100 e CM-Sephadex C-50.

Nos dois microrganismos citados apresentam produção intracelular, mas em sua maioria, a extração e purificação de produções extracelulares tem metodologias muito similares. A principal diferença está no fato de que nem todas as etapas são aplicadas simultaneamente para produção extracelular, sendo selecionadas conforme a necessidade e as características da produção.

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Etapas do mecanismo:

1 - A L-asparagina se encaixa no sítio ativo por meio de ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas,

2 - O grupo amida da L-asparagina é posicionado próximo aos resíduos catalíticos da enzima.

3 - Um resíduo da enzima (geralmente uma serina ou treonina) ataca o carbono do grupo amida da L-asparagina.

4 - Isso forma um intermediário acil-enzimático covalente (como ocorre em serina-hidrolases).

5 - Uma molécula de água entra no sítio ativo.

6 - Ela ataca o intermediário acilado, quebrando a ligação e liberando os produtos: Ácido aspártico e amônia (NH₃)

Reação global:

L-asparagina + H₂O → Ácido aspártico + NH₃

Características cinéticas

Km -

E. coli L-asparaginase: Km ≈ 10–20 µM.

Erwinia L-asparaginase: Km ≈ 30–50 µM.

Vmax

Varia conforme a concentração enzimática.

Para E. coli: pode atingir até 300–500 U/mg.

kcat

E. coli: kcat ≈ 100–400 s⁻¹.

PH

Entre pH 7,3 a 8,5.

Temperatura

Em torno de 37°C.

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A enzima precisa de imobilização/ e ou modificação?

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A enzima precisa de imobilização/ e ou modificação?

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A eficácia da L-asparaginase, tanto em aplicações clínicas quanto industriais, é frequentemente limitada por desafios como baixa estabilidade, curta meia-vida e resposta imunológica. Para superar essas barreiras e otimizar seu desempenho, recorre-se a estratégias de modificação química e imobilização, que aumentam sua robustez e viabilidade econômica.

A principal modificação química aplicada é a peguilação (PEGylation), processo que consiste na ligação covalente de cadeias do polímero polietilenoglicol (PEG) à superfície da enzima. Essa alteração estrutural resulta em vantagens significativas, especialmente no uso clínico. A molécula de PEG cria um "escudo" que maschara os sítios antigênicos da enzima, levando a uma redução da imunogenicidade e, consequentemente, a um menor risco de reações alérgicas. Adicionalmente, o aumento do volume hidrodinâmico da enzima peguilada retarda sua depuração renal, resultando em um aumento da meia-vida plasmática. Isso permite um regime de dosagem menos frequente, melhorando a adesão ao tratamento. A PEG-asparaginase, resultante desse processo, é hoje uma formulação de primeira linha no tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA).

Outra abordagem estratégica, fundamental para aplicações industriais e biotecnológicas, é a imobilização, que consiste no confinamento da enzima a um suporte físico insolúvel. Diversos métodos podem ser utilizados para este fim, como a adsorção em superfícies (interações fracas), a ligação covalente ao suporte (ligação forte e estável) e o aprisionamento em matrizes porosas como géis de alginato ou quitosana. As vantagens da imobilização são notáveis para processos em larga escala:

Reutilização: A enzima pode ser facilmente separada do meio reacional e reutilizada em múltiplos ciclos, o que reduz significativamente os custos operacionais.

Aumento da Estabilidade: O suporte protege a enzima contra desnaturação por variações de pH, temperatura ou presença de solventes, prolongando sua vida útil.

Facilidade de Purificação: O produto final já se encontra naturalmente separado da enzima, simplificando as etapas de downstream processing.

Controle do Processo: Permite a aplicação em biorreatores de leito fixo ou de fluxo contínuo, garantindo maior controle sobre as condições reacionais.