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Las pruebas de coagulación son ensayos funcionales que tienen como objetivo replicar in vitro la activación del sistema de la coagulación y evaluar la funcionalidad del mismo, lo que permite fundamentar y orientar el diagnóstico clínico. Las pruebas clásicas son: el Tiempo de Tromboplastina Parcial activado (TTPa) que evalúa la vía intrínseca; el Tiempo de Protrombina (TP) el cual evalúa la vía extrínseca y el Tiempo de Trombina (TT) que evalúa la vía común. Estas pruebas de laboratorio son útiles para detectar deficiencias congénitas o adquiridas de factores de la coagulación, de allí que se usen para estudiar pacientes con manifestaciones hemorrágicas. En contraste, la deficiencia congénita de la mayoría de las proteínas anticoagulantes como ATIII, PC y PS está asociada a la aparición de un estado de hipercoagulabilidad, protrombótico o trombofilico, sin embargo, en estos casos no se observan alteraciones en las pruebas clásicas, por lo que estas no se emplean en el estudio de pacientes con trombofilias primarias (51-54).
Las pruebas para evaluar la coagulación emplean plasma fresco citratado, el cual debe ser procesado lo más rápidamente posible y mantenerse en frio, sin ser expuesto a contacto directo con hielo. Para la obtención de plasma citratado se extrae sangre por punción venosa, de voluntarios aparentemente sanos, con agujas de 21 G. La sangre se mezcla suavemente en tubos de plástico con citrato de sodio al 3,8% en una proporción 1:9 e inmediatamente se centrifuga a 4°C a 1400 g durante 15 ó 20 minutos para obtener Plasma Pobre en Plaquetas (PPP). Las pruebas se deben realizar lo más rápido posible, sobre todo si se evalúan factores lábiles como el FVIII o FV. Los plasmas no deben almacenarse por más de dos semanas a -20°C o de 6 meses a -70°C (55-56) .

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Pruebas de coagulación ¿Qué son y para qué sirven? (TP, TPT, TTPa, INR) - UVM 01-2021

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Pruebas de coagulación ¿Qué son y para qué sirven? (TP, TPT, TTPa, INR) - UVM 01-2021

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Tiempo de trombina (TT)

El TT mide el tiempo de formación de fibrina a partir del fibrinógeno presente en el plasma, en presencia de una cantidad estandarizada de trombina. Esta prueba es muy útil para determinar la presencia de fibrinógenos anormales (disfibrinogenemias) o bajos niveles de fibrinógeno circulante (hipofibrinogenemias); también da tiempos prolongados en cuadros de coagulación intravascular diseminada, así como también en presencia de heparina, en hiperfibrinólisis primaria y en presencia de productos de degradación de fibrinógeno/fibrina (56, 62).

Para el ensayo, inicialmente se debe preparar una solución de trombina estándar entre 2-3 UI/mL, que debe dar un tiempo de coagulación con un plasma control entre 18 y 22 seg. Con tiempos de coagulación menores a 15 seg debe hacerse una mayor dilución de la trombina (54). En general, se aplica el siguiente procedimiento: se mezclan 0,1 mL de PPP fresco citratado y 0,1 mL de la solución de trombina y se determina el tiempo de coagulación a 37°C.

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Tiempo de tromboplastina parcial activada .

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Tiempo de tromboplastina parcial activada .

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Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)

El TTPa evalúa el funcionamiento de la vía intrínseca de la coagulación y emplea como activadores ácido elágico, celite, sílica o caolín, en presencia de fosfolípidos. Esta prueba detecta la deficiencia de los factores VIII, IX, XI y XII. Adicionalmente, el TTPa se prolonga por deficiencia de los factores de la vía común como V, X, II y el fibrinógeno en menor grado. El TTPa no se altera cuando las deficiencias de los factores son moderadas (>40%). Esta prueba también es muy útil para evaluar el tratamiento con anticoagulantes no orales tipo heparina y para rastrear el anticoagulante lúpico (56,57).

El TTPa también resulta prolongado ante la deficiencia de los factores que intervienen en la fase de contacto, como la precalicreína o los QAPM, a menos que la prueba utilice un reactivo que contenga ácido elágico como activador. En ese caso, esta prueba será normal, incluso ante la ausencia total de dichos factores (57).

Entre los métodos reportados para medir el TTPa están:

a) Tiempo de Tromboplastina con cefalina: Este método fue descrito inicialmente por Langdell y col. en 1953 (58). El procedimiento es el siguiente: Se incuban 0,1 mL de PPP fresco citratado del paciente o del control y 0,1 mL de solución de cefalina a 37°C durante el tiempo recomendado por el fabricante de este reactivo, luego se agregan 0,1 mL de CaCl2 25 mM preincubado a 37°C y se determina el tiempo de coagulación. b) Tiempo de Tromboplastina con caolín: tiene como finalidad unificar la activación por contacto, teniendo en cuenta que los tiempos de incubación cortos son más sensibles para detectar defectos de los factores de contacto. En este método descrito por Proctor y Rapaport en 1961 (59), se sigue el procedimiento siguiente: 0,1 mL de PPP fresco citratado se incuba a 37°C; luego se agregan 0,1 mL de una mezcla de caolín (5%) y cefalina (1/10), se mantiene a 37°C, finalmente se agrega 0,1 mL de CaCl2 25 mM, se mezcla y se determina el tiempo de coagulación. Este método es sensible para seguir tratamientos con anticoagulantes (cumarínicos o heparina) y para evaluar los niveles de los factores de la vía intrínseca, pero no para diagnosticar deficiencias de fibrinógeno y protrombina (55).

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Tiempo de protrombina (TP)

El TP evalúa el funcionamiento de la vía extrínseca de la coagulación. Esta prueba mide el tiempo de formación de un coágulo en presencia de un exceso de factor tisular (FT), representado por la tromboplastina o una mezcla comercial que contiene FT recombinante o de origen tisular, con diferente composición de fosfolípidos y cuya heterogeneidad determina diferentes respuestas ante la disminución en los niveles de algún factor. Es una prueba empleada para la evaluación prequirúrgica, para el seguimiento de pacientes con hepatopatías o con deficiencias de factores de la coagulación. Además, es muy usada para evaluar la terapia anticoagulante con cumarínicos, para lo cual se debe determinar el Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) de la tromboplastina a emplear para poder unificar los resultados. El fabricante de la tromboplastina calcula el valor ISI comparado con una tromboplastina de origen humano estándar internacional a la cual se le asigna un ISI de 1,0; lo que garantiza compensar las distintas sensibilidades de los reactivos disponibles en el mercado (55, 60).

El TP en una etapa reportado por Arocha Piñango y col. (60), fue modificado del método originalmente descrito por Quick en 1935 (61) y es sensible para determinar la deficiencia de los factores VII, X, V y en menor medida las deficiencias de protrombina. Sin embargo, no detecta deficiencias de fibrinógeno, incluso cuando estas son moderadas.

Para realizar el TP se aplica el siguiente procedimiento: se mezclan 0,1 mL de PPP fresco citratado con 0,1 mL de tromboplastina tisular y 0,1 mL de CaCl2 25 mM (estos últimos preincubados a 37°C), se agita y se determina el tiempo de coagulación. Las variaciones entre los duplicados no deben ser mayores a 0,5 seg en tiempos cortos y no más de 2 a 3 seg en tiempos mayores a 30 seg. Los resultados deben expresarse como la relación o cociente entre el tiempo de coagulación obtenido con el plasma del paciente y el plasma control (60). En pacientes tratados con cumarínicos, el resultado debe expresarse como INR o International Normalized Ratio, en español Razón Internacional Normalizada, que se obtiene elevando la relación (r) obtenida entre el paciente y el control al ISI (INR= r ISI), lo que permite comparar los resultados obtenidos con diferentes tromboplastinas comerciales. La OMS recomienda emplear tromboplastinas con un ISI menor a 2,5. El valor del INR tomado como rango terapéutico depende de la patología que motive el tratamiento (60).

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Tiempo de coagulación por ecarina (ECT)

El ECT (por las siglas de su nombre en inglés Ecarin Clotting Time) es una prueba de coagulación basada en la activación de la protrombina por acción de la ecarina, una enzima aislada del veneno de la serpiente Echis carinatus, generando meizotrombina, un precursor catalíticamente activo de la trombina capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina (63).
Esta prueba de coagulación, descrita originalmente por Nowak y Bucha en 1993 (64), exhibe una correlación lineal entre la concentración de inhibidores directos de trombina presentes en el plasma y su tiempo de coagulación. Por esta característica favorable en comparación a los métodos descritos anteriormente, el ECT ha sido ampliamente usado en la caracterización bioquímica y farmacológica de inhibidores directos de trombina y para controlar los niveles de éstos compuestos en la terapia anticoagulante (65-68).

López y Nowak en el año 2008 (68) describieron una modificación a este método que permite cuantificar inhibidores directos de trombina en sangre. Para ello se prepara una solución de ecarina a una concentración final de 1 U/mL en tampón Tris/HCl 50 mM pH 7,5 con NaCl 0,154 M y CaCl2 10 mM, que se preincuba por 5 min a 37°C. Para determinar el ECT, se incuban 0,1 mL de sangre citratada con 0,1 mL de la solución de ecarina, se agita y se determina el tiempo de coagulación. La concentración del inhibidor se determina por comparación con una curva de calibración realizada usando concentraciones conocidas del compuesto en estudio.

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Tiempo de reptilasa (TR)

Es una prueba especial que emplea la reptilasa, una enzima similar a la trombina obtenida del veneno de la serpiente Bothrops atrox, que actúa directamente sobre las cadenas α del fibrinógeno lo que libera el fibrinopéptido A, sin que su acción sea inhibida por la antitrombina, por lo que esta prueba no es afectada por la presencia de heparina. Si el TT está prolongado y el TR es normal, probablemente el plasma evaluado contiene heparina. Si ambos tiempos dan prolongados, pero en mayor proporción el TT, debe sospecharse de la presencia de productos de degradación del fibrinógeno/fibrina. En casos de disfibrinogenemias, esta prueba es más sensible que el TT.

Los valores de TR normales deben encontrarse similares a los obtenidos con una muestra de plasma control, con diferencias dentro de los 3 seg, de allí que deben informarse los valores obtenidos con el plasma del paciente y con el plasma control. La prueba se realiza de manera similar al TT, ajustando el TR del control entre 15 y 18 seg (56).

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Como se realiza el tiempo de coagulación: Método de Lee - White

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Como se realiza el tiempo de coagulación: Método de Lee - White

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Tiempo de coagulación método de Lee y white 

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Tiempo de coagulación método de Lee y white 

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Ensayos de generación de trombina:

Estos ensayos miden la capacidad del plasma de generar trombina luego de que el proceso de coagulación sea activado por el FT o algún otro activador. Dado que la trombina es el mayor efector del proceso de coagulación, los ensayos de generación de trombina muestran mayor potencial para evaluar la tendencia de un individuo a desarrollar eventos trombóticos o hemorrágicos.

Los principales ensayos de generación de trombina descritos hasta el momento son los siguientes:

a) Trombografía calibrada automática: En un inicio, la generación de trombina inducida por FT era determinada en muestras de PPP, usando un sustrato cromogénico (85). Este ensayo requería la remoción del fibrinógeno del plasma, lo que lo hacía un sistema muy distinto al proceso fisiológico de la coagulación. La sustitución del sustrato cromogénico por un sustrato fluorescente, cuya señal no es afectada por la turbidez del plasma, permitió la determinación continua de generación de trombina en plasma rico en plaquetas (PRP). En este ensayo, la concentración de trombina puede ser calculada a partir de curvas de calibración. Sin embargo, este método tiene la desventaja que la señal fluorescente generada por escisión del sustrato no es lineal a la concentración del producto, debido al llamado efecto de filtro interno del sustrato fluorescente. Para compensar esto, se desarrolló el trombograma automatizado calibrado (CAT por Calibrated Automated Thrombography) que compara continuamente la señal de muestras experimentales a una actividad de trombina conocida (86). Las curvas de generación de trombina pueden ser descritas en términos de tiempo de latencia, tiempo para llegar al pico, altura del pico y área bajo la curva; este último parámetro define el Potencial endógeno de trombina (ETP por endogenous thrombin potential). En contraste con el TP, TTPa, TT, que solo evalúan la fase inicial de la coagulación (pues solo son necesarias trazas de trombina para inducir la coagulación de un plasma), estos ensayos de generación de trombina evalúan también las fases de amplificación y propagación, así como la inhibición de la trombina por las diferentes vías anticoagulantes. Recientemente, este método fue adaptado para medir generación de trombina en muestras de sangre total (87).

b) THROGA (por THROmbin Generation Assay): Es un método que se basa en inducir la coagulación por activadores de la vía extrínseca e intrínseca en una muestra de sangre o plasma citratado que contiene una cantidad definida de hirudina. Dado que la trombina formada se unirá a la hirudina formando un complejo con estequiometria de 1:1, es posible calcular las unidades de trombina generadas en función de las unidades de hirudina consumidas en la muestra activada, es decir, al determinar la diferencia de hirudina libre remanente en la muestra estudiada, en comparación con una muestra control preparada en las mismas condiciones pero donde no se indujo el proceso de coagulación (88). Para esto, se debe emplear un método que permita la determinación precisa de hirudina en muestras de sangre y plasma, como el ECT, descrito anteriormente (64).

En conclusión, es importante resaltar la importancia actual de ambos modelos; la cascada de la coagulación que facilita la interpretación in vitro de las pruebas de laboratorio más utilizadas para orientar y fundamentar el diagnóstico clínico, así como, el modelo celular que explica el proceso fisiológico in vivo, donde interactúan además de los factores solubles, diversas células y mecanismos reguladores altamente eficientes, que garantizan que la coagulación sea un proceso localizado y bien controlado. Finalmente, el uso de las diferentes pruebas de coagulación y de métodos más sofisticados y completos como los cromogénicos y los ensayos de generación de trombina, permiten establecer deficiencias de factores de la coagulación específicos, así como la existencia de alguna anormalidad en el sistema de la coagulación que incremente la tendencia a sufrir eventos trombóticos o hemorrágicos. El oportuno análisis del sistema de la coagulación de un individuo permitirá tomar medidas preventivas o correctivas, según cada caso particular.

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Los resultados obtenidos en las diversas pruebas de coagulación de una muestra de plasma en estudio, se comparan con los tiempos de coagulación obtenidos con un plasma control, el cual se prepara mezclando el plasma de al menos tres personas aparentemente sanas, cuyos tiempos de coagulación individuales estén dentro de los valores normales establecidos por cada laboratorio. Los ensayos con ambas muestras se deben realizar en paralelo y por el mismo operador. La sensibilidad de estas pruebas está vinculada al reactivo y a la técnica utilizada, de allí que es importante establecer los rangos de referencia de cada laboratorio e indicar la fuente de los reactivos empleados (55-56).
Cuando el tiempo de coagulación de la muestra en estudio es muy prologado debe realizarse la corrección con plasma control, es decir, mezclar plasma del paciente con plasma control en una proporción 1:1. Si la alteración en el tiempo de coagulación se corrige, se está ante la deficiencia de algún factor de la coagulación, mas si no se corrige, se está ante la posible presencia de algún inhibidor.

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https://www.cqssalud.com/principales-pruebas-de-coagulacion/

http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0535-51332015000400010
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Hola