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Ao concluir a experiência, observou-se a predominância de bacilos na microscopia, os quais não eram esperados com base nas pesquisas prévias sobre as bactérias presentes na pele. Esse resultado pode ter ocorrido devido à área de coleta do swab, que foi realizada na região facial, uma área que, em comparação com outras regiões mais expostas a fatores ambientais, como as mãos, os pés ou as juntas, tende a apresentar uma menor carga bacteriana e, frequentemente, uma composição bacteriana diferente. A pele do rosto é geralmente mais protegida e menos sujeita a contaminações diretas do ambiente, o que pode resultar em uma microbiota mais equilibrada, com a predominância de espécies menos agressivas, como bacilos. Em contrapartida, áreas mais propensas a acumular sujeira e secreções, como as mãos e os pés, podem ter uma maior diversidade e quantidade de microrganismos. Portanto, o local de coleta do swab pode ter influenciado a composição bacteriana observada, refletindo as características específicas da microbiota da região facial.

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Inicialmente, os resultados esperados antes da execução do projeto indicavam a presença de Staphylococcus e Streptococcus, bactérias Gram-positivas, e a ausência de bactérias infecciosas. No entanto, as conclusões obtidas em laboratório demonstraram unicamente a presença de Bacilos Gram-positivas, uma vez que o nível de contaminação foi baixo, o que pode ser atribuído à adequada higienização dos materiais e ambiente de trabalho e de uma pele devidamente higienizada.

Embora a coloração de Gram tenha sido uma ferramenta essencial no diagnóstico bacteriano, sua aplicação exclusiva a bactérias e a limitação na distinção entre subgrupos bacterianos podem restringir uma compreensão mais completa da microbiota humana, logo que amostras coletadas diretamente da placa variam de concentração, permitindo a utilização para exemplificação de outra equipe, a qual analisou igualmente a microbiota de pele, porém de outra parte da placa, concluindo um projeto mais vasto e completo perante a análise microscópica em comparação a análise do grupo "triviólitos".

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A partir de uma avaliação escolar, o objetivo dos alunos do 3º ano A foi a produção e análise de uma microbiota humana, utilizando amostras de pele obtidas por meio de swabs. Este procedimento visou a comprovação do conhecimento didático relacionado ao conteúdo abordado em sala de aula, avaliando de maneira individual o êxito de uma atividade coletiva. O processo no laboratório foi conduzido de forma leve, mas mostrou-se complexo e desafiador no que diz respeito à produção textual dos resultados.

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A partir da análise da conclusão do experimento realizado, será possível observar a conclusão do processo de integração entre o estudo teórico e a comprovação experimental por meio de testes científicos no campo da microbiologia, com foco na coloração de Gram. Esse processo proporcionará aos estudantes a oportunidade de abrir discussões e tirar conclusões sobre o experimento, possibilitando a comparação entre hipóteses formuladas e os resultados obtidos, a retomada e reflexão crítica diante da conclusão do projeto, possuindo uma argumentação sustentada de forma científica, embasada em um histórico bibliográfico coerente à temática em questão.

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A coloração de Gram, classifica as bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas, baseando-se na capacidade de absorção de corante, que está direcionada à estrutura da parede celular bacteriana. Bactérias Gram-positivas: possuem uma parede celular espessa, composta principalmente por peptidoglicano, que retém o corante cristal violeta, resultando em uma coloração roxa.

Bactérias Gram-negativas: possuem uma parede celular mais fina e uma membrana externa, que impede a retenção do corante, resultando em uma coloração vermelha quando a safranina é utilizada.

Embora a coloração de Gram seja uma ferramenta útil para a identificação inicial de bactérias, ela tem limitações quando se trata de um estudo mais profundo da microbiota humana, a técnica não distingue todas as espécies de microrganismos, especialmente quando se trata de microrganismos com paredes celulares incomuns ou sem parede celular, invalidando em grandes casos o seu uso para a identificação inicial, falhando o êxito na reflexão de toda a complexidade da microbiota.

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A microbiota humana é essencial para diversas funções fisiológicas, como a digestão de certos nutrientes, a produção de vitaminas e o fortalecimento do sistema imunológico. Estudos recentes têm mostrado que desequilíbrios na microbiota, conhecidos como disbiose, podem estar associados a diversas doenças, como obesidade, diabetes, doenças autoimunes e até mesmo doenças neurológicas, entretanto, a diversidade da microbiota humana a transforma em complexa, pois a composição microbiológica varia de acordo com o ambiente em que o indivíduo vive, sua dieta, medicamentos ingeridos e outros fatores rotineiros.

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A microbiota humana, composta por abrangentes microrganismos, desempenha um papel fundamental na manutenção da saúde humana. Ela é composta por uma vasta quantidade de bactérias, vírus, fungos e outros microrganismos que habitam diversas regiões do corpo, como o intestino, a pele, a boca e o sistema respiratório. Dentre os principais métodos utilizados para estudar as bactérias presentes na microbiota, a coloração de Gram é o metodo mais tradicional para o reconhecimento do estudo, permitindo a classificação das bactérias em dois grupos principais: Gram-positivas e Gram-negativas, embasadas na estrutura da parede celular.

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Extensa variedade de espécimes bacterianos pode ser isolada nas amostras biológicas, com vistas ao diagnóstico do agente etiológico de uma infecção. Uma das principais formas de se categorizar as bactérias, consiste na análise de suas características morfotinturiais (forma, arranjos/grupamentos das células e sua afinidade pelos corantes).

Uma das etapas mais importantes para o auxílio diagnóstico do patógeno causal de uma infecção, consiste na sua análise microscópica direta, através do material biológico obtido diretamente do local onde se pretende investigar (o mesmo material que será utilizado para a cultura).

Para o exame bacteriológico direto, existem diversos métodos de coloração que podem ser utilizados no laboratório de microbiologia clínica (ex.: tinta nanquim, Ziehl-Neelsen, Albert-Laybourn), sendo a coloração de Gram, indiscutivelmente, a mais amplamente disponível e utilizada.
Leia também: A Patologia Clínica/Medicina Laboratorial fazendo o futuro acontecer
Coloração de Gram

É uma técnica de coloração secular, descrita em 1884 pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, que consiste na preparação de um esfregaço em lâmina de vidro para microscopia, de preferência da porção mais purulenta/sanguinolenta da amostra.

No caso de líquidos corporais, pode-se realizar uma citocentrifugação para se concentrar o material, obtendo assim uma melhor visualização das estruturas. A amostra é então mantida em ar ambiente para sua secagem e fixada por metanol ou por meio de um leve aquecimento. Um corante (cristal violeta) é adicionado, por um a dois minutos, e, em seguida, inserido o lugol, também por um a dois minutos. Dessa reação, forma-se o complexo iodo-pararrosalina na parede celular das bactérias, que coram-se de roxo (nessa fase, tanto as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas retêm o corante).

Na próxima etapa, após a lavagem da lâmina, inicia-se a etapa de descoloração, acrescentando-se uma solução de álcool-éter ou de álcool-acetona ao material. Nesse momento, em virtude das diferenças entre a constituição das paredes celulares (as bactérias Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicanos e de ácidos teicóicos, já nas Gram-negativas essa camada é mais delgada, com maior proporção lipídica), as Gram-positivas resistem à descoloração, retendo o corante, permanecendo roxas. Em contrapartida, as finas e lipídicas paredes celulares das bactérias Gram-negativas, quando expostas ao álcool, fazem com que as mesmas percam o corante, tornando-se incolores.

Na fase de contra-coloração, após uma lavagem da lâmina com água, é adicionado safranina (corante de cor vermelha), o qual é o responsável pela coloração avermelhada das bactérias Gram-negativas. Nova lavagem com água é realizada, secando-se cuidadosamente o material em seguida. A lâmina é então colocada no microscópio, sendo primeiramente visualizada em objetiva de pequeno aumento, para em seguida ser observada em objetiva de imersão em óleo (aumento de mil vezes).
Mais do autor: Qual a importância da ordem correta na coleta de exames laboratoriais? Alguns exemplos de bactérias, suas características morfotinturiais e respectivas infecções mais relacionadas:

Cocos Gram-positivos: Staphylococcus aureus (infecções de pele e partes moles, síndrome do choque tóxico, bacteremia); Streptococcus pyogenes (infecções de pele e partes moles, faringite e suas complicações não supurativas), Streptococcus agalactiae (meningite, bacteremia neonatal); Streptococcus pneumoniae (pneumonia comunitária, meningite); Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium (bacteremia e infecções nosocomiais do trato urinário);

Cocos Gram-negativos: Neisseria meningitidis (meningite); Neisseria gonorrhoeae (gonorreia); Moraxella catarrhalis (otite média em crianças, sinusite, pneumonia);

Bacilos Gram-positivos: Listeria monocytogenes (meningite, bacteremia); Nocardia sp. (pneumonia, infecções de partes moles, abscesso cerebral); Bacillus anthracis (infecções de pele e partes moles, pneumonia, utilizado como um agente de bioterrorismo); Corynebacterium diphtheriae (difteria);

Bacilos Gram-negativos: Escherichia coli (infecção do trato urinário, diarreia, bacteremia); Klebsiella pneumoniae e Klebsiella oxytoca (infecção do trato urinário, diarreia, bacteremia); Proteus sp. (infecção do trato urinário); Salmonella sp. (diarreia, febre tifoide); Shigella sp. (diarreia); Enterobacter sp. (pneumonia nosocomial, infecção do trato urinário, bacteremia); Serratia sp. (pneumonia nosocomial); Pseudomonas aeruginosa; Acinetobacter baumanii; Campylobacter; Helicobacter; Legionella sp.; Bordetella sp.; Brucella sp.; Haemophilus sp.

Limitações da técnica

Dentre as limitações da coloração de Gram, podemos destacar:

Fornece um diagnóstico presuntivo/preliminar;

Só é capaz de identificar até o gênero bacteriano, não sendo possível, na maioria dos casos, o diagnóstico a nível de espécie;

Necessita de um grande número/concentração de patógenos na amostra para uma melhor sensibilidade;

Baixa acurácia em espécimes clínicas que possuem naturalmente alta presença de flora bacteriana normal (ex.: fezes, swab orofaríngeo e retal, pele);

Alguns microrganismos não se coram adequadamente pelo Gram (ex.: Treponema pallidum, espécies de Legionella, Mycoplasma e Mycobactérias).

Conclusão

Apesar de ser uma técnica antiga, possuir algumas limitações e da disponibilidade de técnicas mais avançadas de identificação bacteriana, a coloração pelo Gram ainda é muito utilizada nos dias de hoje pelo setor de microbiologia. Sua grande vantagem consiste na sua rápida, fácil e barata execução, fornecendo assim valiosas informações no sentido de orientar o diagnóstico presuntivo, o início precoce e guiado do tratamento e a avaliação, pelo laboratório clínico, da qualidade da amostra coletada.
Referências bibliográficas:

Jacobs DS, Demott WR, Oxley DK. Jacobs & demott laboratory test handbook with key word index, 5th ed. Hudson, OH: Lexi-Comp, Inc; 2001.

Kanaan S. Laboratório com interpretações clínicas. 1a ed. Rio de Janeiro: Atheneu; 2019.

McPherson RA, Pincus MR, eds. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 23rd ed. St. Louis, MO: Elsevier; 2017.

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Microbiologia: em que consiste, características e utilidade da coloração de Gram - Portal Afya

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Para o exame bacteriológico direto, existem diversos métodos de coloração, sendo a coloração de Gram a mais utilizada.

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Staphylococcus aureus: Cocos gram-positivos

A técnica de Gram, mundialmente conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método que consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de gram-negativas.

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias gram-negativas não o fazem.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como gram-positivas ou gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente provoca a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.

Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

Confeccionar o esfregaço;

Corar com cristal de violeta por 60 segundos;

Lavar com esguicho de água destilada;

Cobrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;

Lavar com esguicho de água destilada;

Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;

Lavar com esguicho de água destilada;

Corar com fucsina por 20 segundos

Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio.

Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) cor de rosa

Pseudomonas aeruginosa: Bacilos gram-negativos

As características estruturais da parede bacteriana estão na base da técnica de Gram que funciona da seguinte forma.

O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactéria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante- iodo, insolúvel em água, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidoglicano é maior em bactérias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e são coradas pelo vermelho de safranina.

A lavagem com álcool 99,5º GL dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permeável a este, arrasta-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a lavagem com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas nas bactérias gram-negativas. Resumindo, as bactérias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento celular ou acção de lisozimas).

Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e algumas refringência e mobilidade.

A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.

A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzênicos que se encontram ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes: os corantes ácidos (são negativos, formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos, formando sais com ânions). Como as bactérias possuem carga eléctrica negativa, existe afinidade entre os corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria, permitindo que esta fique corada. Para reforçar a ação do corante, aumentando a força de ligação deste, as estruturas celulares utilizam-se de mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fênico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias, sendo geralmente hidro-alcoólicos-fenicados porque, além da substância corante, possuem água para permitir a dissociação iônica do corante; álcool para conservar e ácido fênico, que atua como mordente e como bacteriostático, evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante, aplica-se um diferenciador, que serve para retirar o excesso de corante ( acetona, ácido sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já previamente coradas e são usados em colorações policromáticas.

A preparação de colorações policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo calor), aplica-se:

O primeiro corante

O diferenciador

Água (vai parar a diferenciação)

Segundo corante (vai ser contrastante)

Referências

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Técnica de Gram - Wikipédia, a enciclopédia livre

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A técnica de Gram, mundialmente conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos.

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A maior parte dos leitores deste artigo provavelmente se espantará ao saber que a maioria das células presentes em nosso organismo não é humana. Essa maioria não humana é encontrada nas comunidades microbianas riquíssimas que habitam nosso corpo. A existência dessas comunidades é conhecida desde que o holandês Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) observou, em um de seus microscópios, um raspado da superfície de seus dentes e descobriu um grande número de minúsculos seres vivos, com as mais variadas formas.

Nas últimas décadas, o estudo dos microrganismos que hospedamos cresceu vertiginosamente, dando origem a um novo campo da microbiologia. Desde então, essa comunidade amigável de minúsculos seres vem sendo chamada de microbiota (ou ainda flora, microflora e microbioma, entre outros nomes). Embora não a enxerguemos a olho nu, a microbiota é parte importante de nosso organismo. Estima-se, por exemplo, que mais da metade do material das fezes seja composto por células microbianas.

Calcula-se que, no corpo de um adulto, exista cerca de 1 kg de micróbios. O papel importante desses seres microscópicos fica ainda mais evidente quando comparamos o número de células humanas e microbianas no nosso corpo. Estimativas dizem que há 10 vezes mais micróbios em nossos corpos do que nossas próprias células. Em outras palavras, quanto ao número de células, somos 90% micróbios e apenas 10% humanos.

Se calcularmos o número de genes microbianos presentes em nosso corpo, chegamos à impressionante conclusão de que abrigamos 100 vezes mais genes microbianos do que humanos

Mas a coisa não para por aí. Assim como os humanos, esses microrganismos também têm seus genes, que determinam como eles vivem e interagem com outros organismos. Se calcularmos o número de genes microbianos presentes em nosso corpo, chegamos à impressionante conclusão de que abrigamos 100 vezes mais genes microbianos do que humanos. Assim, em termos de número de genes, somos 99% micróbios e apenas 1% humanos.

Os microrganismos que vivem no corpo humano colonizam virtualmente todas as superfícies expostas ao ambiente externo. A microbiota está presente na boca, no estômago, no intestino, nos tratos genitourinário e respiratório, nos olhos, na pele etc. Embora esta se distribua por todas as áreas de contato com o exterior, a maior parte da colonização (cerca de 70%) ocorre no trato gastrointestinal.

Isso se deve em grande parte ao fato de a área das paredes intestinais de um adulto ser equivalente à de uma quadra de tênis - é, portanto, um imenso espaço para interações entre o tecido humano e os micróbios.

Essa associação começa cedo. No instante em que nasce, por parto normal, o bebê é colonizado por bactérias do canal vaginal da mãe. Já bebês que nascem por cesariana têm uma microbiota diferente, composta principalmente por micróbios da pele da mãe e dos profissionais de saúde envolvidos no parto. Após a colonização inicial, a comunidade microbiana do bebê é simples e instável. Entretanto, após o primeiro ano de vida, a composição desta se estabiliza e se torna semelhante à de um adulto. A partir daí, a microbiota continua evoluindo, mas de forma mais estável.

Além dessa variação no tempo, o conjunto de microrganismos também exibe grandes diferenças espaciais. No trato gastrointestinal, por exemplo, cada segmento do tubo digestivo tem micróbios relativamente específicos. No estômago, são comuns bactérias dos gêneros Lactobacillus, Veillonella e Helicobacter. No intestino delgado, predominam estreptococos, actinobactérias e corinebactérias. No intestino grosso, algumas das bactérias mais abundantes são os gêneros Bacteroides e Clostridium.

A composição microbiana no intestino também varia de acordo com a distância de cada microambiente em relação às paredes do tubo intestinal. A superfície do epitélio intestinal é, com poucas exceções, não colonizada. Já a camada de muco que recobre esse epitélio abriga bactérias características, como as dos gêneros Clostridium, Lactobacillus e Enterococcus. O espaço interno (lúmen) do trato gastrointestinal, por sua vez, é rico em outros gêneros ( Bacteroides, Bifidobacterium), além de enterobactérias em geral. Esses padrões de colonização são influenciados por muitos aspectos, entre eles a distribuição de nutrientes e oxigênio, os níveis de acidez ou alcalinidade e a presença ou ausência de sítios específicos de ligação.

Papéis fundamentais

Todas essas observações deixam claro que as bactérias que colonizam o corpo humano devem exercer funções muito importantes. De fato, dezenas de estudos têm demonstrado que elas são fundamentais para a saúde. Grande parte desses estudos usou animais de laboratório, nos quais a microbiota foi de algum modo manipulada.

De início, camundongos eram tratados com antibióticos, que reduziam a níveis mínimos a população microbiana em seu intestino, e os efeitos desse tratamento eram registrados e investigados. Em seguida, foram desenvolvidos métodos mais sofisticados para o estudo da microbiota.

Estudos com animais livres de germes levaram à identificação de papéis fundamentais da comunidade microbiana na saúde animal (e, por extensão, na saúde humana)

Camundongos paridos por cirurgia cesariana eram mantidos em condições totalmente assépticas, na ausência de qualquer tipo de microrganismo. Esses animais eram chamados de germ-free (livres de germes). Durante seu crescimento, em laboratório, diversos aspectos fisiológicos eram monitorados. Estudos como estes levaram à identificação de papéis fundamentais da comunidade microbiana na saúde dos animais (e, por extensão, na saúde humana).

Um exemplo é a função crítica da microbiota na proteção de seus hospedeiros contra a invasão por microrganismos causadores de doenças. Já era bem conhecida a maior incidência de infecções intestinais em indivíduos tratados com antibióticos. Um dos principais agentes dessas infecções é a bactéria Clostridium difficile, que causa a colite pseudomembranosa (inflamação do cólon que leva a diarreia e pode ser fatal). O surgimento dessa colite está associada ao uso de antibióticos de amplo espectro.

C. difficile pode ser encontrada na microbiota intestinal humana, e em geral não causa qualquer dano ao hospedeiro. No entanto, quando um antibiótico é usado para tratar uma infecção, esse conjunto de microrganismos é severamente alterado, o que propicia a expansão de C. difficile no intestino do hospedeiro. Como essa bactéria produz fatores de virulência, inclusive toxinas, o aumento de sua população desencadeia a colite pseudomembranosa.

Além dessas observações clínicas, estudos de laboratório, nas décadas de 1950 e 1960, confirmaram que o uso de antibióticos pode aumentar a sensibilidade a infecções intestinais. Camundongos tratados com estreptomicina, que apresentaram alterações drásticas na composição da microbiota intestinal, foram então infectados com a bactéria Salmonella, que causa gastroenterite em humanos, e os cientistas verificaram que os distúrbios na comunidade microbiana tornaram os animais muito mais suscetíveis à infecção por essa bactéria, assim como no caso de C. difficile.

Os mecanismos envolvidos na proteção gerada pela microbiota ainda são em grande parte desconhecidos. Acredita-se que essas bactérias funcionem como exímios competidores por nutrientes e sítios de ligação. As bactérias benéficas impediriam os agentes patogênicos de encontrar receptores e se ligar às células do intestino, levando à rápida eliminação destes. Além disso, a alta carga microbiana deixaria poucos nutrientes disponíveis para os agentes patogênicos que achassem um sítio de ligação. No entanto, muitos outros possíveis mecanismos são discutidos atualmente.

Você leu apenas o início do artigo publicado na CH 316. Clique aqui para acessar uma edição resumida da revista e ler o texto completo.

Luis Caetano Martha Antunes
Centro de Referência Professor Hélio Fraga
Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca
Fundação Oswaldo Cruz

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A maior parte dos leitores deste artigo provavelmente se espantará ao saber que a maioria das células presentes em nosso organismo não é humana. Essa maioria não humana é encontrada nas comunidades microbianas riquíssimas que habitam nosso corpo.

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Bactérias são organismos unicelulares que não possuem núcleo definido nem organelas membranosas. Podem ser classificadas de acordo com o seu formato, sendo as formas mais comuns a esférica, a de bastão e a espiralada. Muito conhecidas por causarem doenças nos seres humanos, as bactérias apresentam também sua importância, atuando, por exemplo, na decomposição da matéria orgânica e sendo utilizadas na fabricação de alimentos, como iogurtes.

As bactérias inicialmente eram agrupadas no Reino Monera, no qual todos os procariontes estavam incluídos. Com a classificação dos seres vivos em três domínios, o Reino Monera deixou de existir. Os organismos procariontes, então, são divididos em dois grupos:o domínio Archaea e o domínio Bacteria.

Leia também: Três domínios - a divisão dos seres vivos que se baseia em aspectos evolutivos

Tópicos deste artigo

Características gerais das bactérias

As bactérias são organismos formados por uma única célula (unicelulares) e podem ocorrer isoladas ou formando agrupamentos. Vale dizer também que as células das bactérias são menores que as células eucariontes.Enquanto as bactérias apresentam, normalmente, um diâmetro compreendido entre 1 µm e 5 µm, as células eucariontes possuem diâmetro entre 10 µm e 100 µm.

As bactérias são seres procariontes, ou seja, não possuem núcleo definido, e seu material genético está concentrado em uma região que não é envolta por membrana. Essa região é denominada nucleoide. Além do material genético presente no nucleoide, nas bactérias podem ser observadas moléculas circulares de DNA pequenas - chamadas de plasmídeos -, as quais se replicam independentemente.

Nas células bacterianas, estão ausentes também as organelas celulares, estruturas envolvidas por membranas que são encontradas suspensas no citosol de células eucariontes. Ribossomos estão presentes nesse tipo celular, entretanto são diferentes daqueles observados nas células eucariontes, apresentando-se menores e com diferenças em relação ao conteúdo proteico e RNA.

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As células bacterianas são dotadas de parede celular, uma estrutura localizada externamente à membrana plasmática. A função da parede celular é garantir a manutenção do formato da célula e protegê-la.

Para se movimentarem, muitas espécies de bactérias contam com flagelos. Essas estruturas podem ocorrer em toda a superfície da célula ou estarem concentradas nas extremidades. As bactérias podem apresentar também as chamadas fímbrias, que são estruturas filamentosas, semelhantes a pelos, utilizadas por esses organismos para se aderir ao substrato.

Outro apêndice encontrado nas bactérias são os pili, que são estruturas que mantêm as células unidas durante a transferência de DNA. Alguns autores trazem pili e fímbria como sinônimos, indicando como pili sexuais os apêndices relacionados com a transferência de material genético.
Leia também: Diferenças entre células procariontes e eucariontes
Bactérias gram-positivas e gram-negativas

Uma técnica denominadacoloração de Gram permite classificar as bactérias em dois grupos, por meio da análise das diferenças existentes na composição da parede celular. Quando submetida à coloração de Gram, a parede celular das bactérias pode adquirir coloração violeta ou vermelha. As bactérias coradas de violeta são chamadas de gram-positivas e se caracterizam por apresentar uma parede celular mais simples e rica em peptideoglicano. As bactérias gram-negativas, por sua vez, coram-se em vermelho e apresentam uma estrutura mais complexa, com menos peptideoglicano.

Determinar se uma bactéria é gram-positiva ou gram-negativa é importante para indicar, por exemplo, que tratamento deve ser adotado em caso de infecções. As bactérias gram-negativas, por exemplo, são, em geral, mais resistentes aos antibióticos que as gram-positivas.

Classificação das bactérias

As bactérias são classificadas de diferentes formas, sendo uma delas o formato de suas células.

Observe os principais formatos apresentados pelas bactérias.

Cocos: bactérias que apresentam formato esférico. Podem ocorrer isoladas ou em agrupamentos. Quando ocorrem aos pares, são denominadas diplococos; quando formam uma cadeia, são denominadas estreptococos; quando se agrupam como um cacho de uva, são chamadas de estafilococos.

Bacilos: bactérias que apresentam formato de bastão. Podem ocorrer isoladamente, aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos).

Espirilos: bactérias com formato helicoidal e rígidas.

Espiroquetas: bactérias com formato helicoidal e flexíveis.

Vibrião: bactérias que apresentam formato de vírgula.

Reprodução das bactérias

A maioria das bactérias se reproduz por divisão binária, um processo assexuado em que uma bactéria se divide em duas. As células-filhas são geneticamente iguais, sendo chamadas de clones. O processo é relativamente rápido e, em condições adequadas, algumas espécies são capazes de dar origem a uma nova geração em apenas 20 minutos.

As bactérias podem se reproduzir por divisão binária.

As bactérias podem realizar processos de recombinação genética, o que promove variabilidade genética. A recombinação genética pode ocorrer por meio de três processos.
Leia também: O perigo das superbactérias - bactérias que apresentam elevada resistência a antibióticos

Conjugação: duas bactérias se unem, e uma bactéria doa DNA para outra.

Transformação: bactérias incorporam fragmentos de DNA que estão livres no meio.

Transdução: bacteriófagos (vírus que infectam bactérias) carregam genes de uma bactéria para outra.

Importância das bactérias

As bactérias, diferentemente do que muitos pensam, não são responsáveis apenas por causar prejuízos aos seres humanos, havendo muitas espécies importantes para a nossa saúde. No nosso intestino, por exemplo, há várias espécies de bactérias, as quais são fundamentais para garantir o funcionamento normal do órgão. A nossa microbiota intestinal auxilia na absorção de nutrientes, produz vitaminas e auxilia a evitar a proliferação de agentes patogênicos.

Nosso intestino é repleto de bactérias benéficas, que auxiliam no funcionamento adequado do órgão.

Leia também: Fasciíte necrosante: a doença da bactéria comedora de carne
Economicamente, as bactérias são importantes, por exemplo, por serem usadas na fabricação de vinagre e iogurte. Não podemos nos esquecer também da toxina botulínica, produzida pela espécie Clostridium botulinum. Essa toxina é bastante utilizada para amenizar rugas e linhas de expressão. Alguns antibióticos também são produzidos por bactérias.

As bactérias também apresentam importância ecológica, atuando, por exemplo, na decomposição da matéria orgânica, junto com os fungos. As bactérias também participam do ciclo do nitrogênio.

Doenças causadas por bactérias

Várias são as doenças causadas por bactérias, sendo algumas extremamente graves, podendo até mesmo levar o indivíduo à morte. Essas doenças são tratadas com medicamentos chamados de antibióticos. Veja a seguir exemplos de algumas doenças causadas por bactérias.

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Bactérias: características, tipos, reprodução - Brasil Escola

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Saiba mais sobre as bactérias clicando aqui. Confira as características gerais, reprodução e classificação desses seres procariontes.

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A presença de bacilos Gram-positivos em amostras de pele pode indicar a presença de microrganismos naturais da microbiota cutânea, geralmente agentes inofensivos e até benéficos em condições normais.

O gênero mais comum é corynebacterium, caso a flora esteja desregulada ele se torna patogênica, indicando infecções.

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As bactérias apresentaram uma caraterística morfológica de bacilos (bastonetes). Além disso, a coloração roxa indica que essas bactérias retiveram o corante cristal violeta durante o processo da coloração de Gram, confirmando sua classificação gram-positiva.

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Observação do material microbiana da pele- 

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Observação do material microbiana da pele- 

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Após o preparo, a lâmina foi observada no microscópio óptico com o uso da objetiva 100x para melhor definição da imagem.

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Aplicamos o álcool-acetona sobre o esfregaço, deixando-o agir por 30 segundos. Imediatamente, enxaguamos com água destilada. O objetivo do álcool é dissolver a membrana externa das bactérias gram-negativas, perdendo a coloração roxa. As Gram-positivas permaneceram roxas, pois possuem uma parede celular espessa que retém o corante.

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Após certificar que o esfregaço bacteriano está seco e fixado na lâmina, posicionamos a lamínula pelas bordas, encostando delicadamente na amostra. A lamínula é essencial para garantir uma visualização clara e precisa no microscópio, evitando formação de bolhas de ar que podem dificultar a visualização.

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Aplicamos o contra corante Safranina sobre o esfregaço cobrindo totalmente a área, deixando-o agir por 1 minuto. Depois enxaguamos com água destilada. As bactérias gram-negativas, irão absorver o corante vermelho da Safranina e as gram-positivas continuaram roxas.

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Aplicamos o Lugol sobre o esfregaço cobrindo toda a superfície, deixando-o agir por 1 minuto. Após isso, enxaguamos novamente com água destilada. O Lugol reage com o cristal violeta, formando um complexo insolúvel que se fixa na parede da célula das bactérias gram-positivas.

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Para iniciar o processo de coloração, usamos o corante primário, cristal violeta. Aplicamos algumas gotas sobre o esfregaço, cobrindo todo o material bacteriano, deixando-o agir por 1 minuto. Em seguida, enxaguamos com água destilada para remover o excesso de corante. Todas as bactérias inicialmente assumiram a coloração roxa.

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A coloração de Gram revelou a predominância de bactérias Gram-positivas na amostra coletada da pele do rosto. Isso era esperado, pois a microbiota cutânea saudável é composta majoritariamente por microrganismos como Corynebacterium , que se adaptam às condições da pele, como oleosidade e pH levemente ácido.

A ausência de bactérias Gram-negativas sugere que não houve contaminação significativa por microrganismos externos, o que pode estar relacionado a boas práticas de higiene ou à baixa exposição da pele a superfícies contaminadas antes da coleta. Além disso, o crescimento bacteriano adequado no meio de cultura indica que as condições experimentais foram apropriadas para a sobrevivência dos microrganismos presentes na amostra.

Os resultados obtidos demonstram a eficiência da coloração de Gram na diferenciação de bactérias e reforçam a importância da microbiota natural na proteção da pele contra agentes patogênicos.

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A fixação da bactéria ocorre para aderir a bactéria ao vidro e preservar a morfologia das células. Com isso, segurando a lâmina pela extremidade passamos rapidamente pela chama do bico de Busen, movendo de um lado para o outro.

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Espalhamos cuidadosamente, a ponta do swab no centro da lamina limpa , esfregando com movimentos circulares para distribuir bem a bactéria, formando uma camada fina e uniforme.

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Inicialmente, foi realizado a retirada da colônia de bactérias do meio de cultura. Para isso, tocamos o swab suavemente sobre a colônia, evitando pressionar com força para não danificar o meio de cultura. Assim, retiramos uma pequena quantidade de material bacteriano,

A fim de evitar contaminação foi utilizado EPI´s de segurança, mascara, luvas e jaleco.

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Corante cristal violeta

Corante Safranina

Lugol

Água destilada

Álcool-acetona

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Gram-positiva:

possuem parede celular espessa composta de varias camadas de peptidoglicano. As bactérias adquirem coloração azul ou violeta escura após a coloração de Gram.

Gram-negativo:

Parede celular mais complexa, com uma camada mais estreita de peptidoglicano. As bactérias adquirem coloração vermelha ou rosa após a coloração de Gram.

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A coloração de gram é uma técnica laboratorial , criada por Hans Cristian Gram, usada para classificar a bactéria com base na estrutura da parede celular. Sendo essencial para identificação e diagnóstico de doenças infecciosas.

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Por fim, com o auxílio de um swab e utilizando luvas descartáveis, coletamos com o tempo cronometrado de 1 minuto amostras da pele boca e nariz, para a análise das bactérias existentes em cada região. Após isso, esfregamos uniformemente a amostra ao meio de cultura. Todas as coletas foram feitas em ambiente limpos e com materiais esterilizados para facilitar a observação e evitar contaminação.

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4. Distribuição da solução em placas de petri para solidificar- 

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4. Distribuição da solução em placas de petri para solidificar- 

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Para finalizar a preparação do meio de cultura, distribuímos a solução por proporções iguais em três placas de petri, em que cada uma recebeu sua amostra específica. O meio de cultura foi deixado em temperatura ambiente até começar a solidificar.

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• Adição do cloreto de sódio, dextrose, caldo de carne e cetoconazol- 

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• Adição do cloreto de sódio, dextrose, caldo de carne e cetoconazol- 

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• Segunda retirada dos resíduos da mistura com auxílio de uma peneira- 

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• Segunda retirada dos resíduos da mistura com auxílio de uma peneira- 

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• Mistura da água com a gelatina incolor- 

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• Mistura da água com a gelatina incolor- 

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• Dextrose, cloreto de sódio e caldo de carne- 

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• Dextrose, cloreto de sódio e caldo de carne- 

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3. Aplicação dos nutrientes e segunda retirada dos resíduos- 

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3. Aplicação dos nutrientes e segunda retirada dos resíduos- 

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Colocamos o cloreto de sódio, a dextrose e o caldo de legumes no béquer com a gelatina diluída, mexemos até obter uma mistura homogênea. Após isso, peneiramos pela segunda vez para garantir toda a retirada dos resíduos que não se misturaram durante o processo, para que não afete o meio de cultura.

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A gelatina incolor é utilizada no meio de cultura para solidificar o meio e auxiliar na detecção de algumas produções de enzimas

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2. Medição da água e diluição da gelatina- 

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2. Medição da água e diluição da gelatina- 

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Adicionamos em um béquer 200 ml de água quente. Em seguida, misturamos 12g de gelatina incolor e misturamos até que estivesse completamente dissolvido. Após isso, peneiramos a mistura para retirar todos os resíduos de gelatina.

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A dextrose funciona como nutriente essencial, fornece energia e contribui para estabilidade do meio.

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O cloreto de sódio em meios de cultura ajudam no controle osmótico mantendo condições ideais para o crescimento microbiano.

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O caldo de legumes tem a função de fornecer nutrientes para o crescimento de microrganismo que servem como fonte de energia.

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Pesagem:

Com o auxílio de uma balança de precisão, pesamos a quantidade correta do caldo de legumes, cloreto de sódio e dextrose, para assim garantir a eficácia do resultado final.

Obtemos as seguintes medidas:

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Materiais:

Dextrose (1g)

Água (200ml)

Cloreto de sódio (0,5g)

Gelatina incolor (12g)

Caldo de carne (0,5g)

placa de petri

cetenozol (5mg)

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A analise da microbiota envolve varias etapas, desde a coleta das amostras até o preparo e cultivo dos microrganismos.

Assim, dando inicio a nossa prática, foi escolhido um membro de cada equipe para a realização da coleta da amostras. No nosso grupo, o aluno Gilvan de Magalhães ficou responsável por tal atribuição.

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É o conjunto de microrganismos que vivem no corpo humano, especialmente no trato gastrointestinal, pele e mucosas. Ela é fundamental para o equilíbrio do organismo e o funcionamento do sistema imunológico e metabólico, ajudando a combater agentes invasores e regular respostas inflamatórias. Além de auxiliar na produção de vitaminas na defesa contra organismos patogênicos. Quando ocorre um desequilíbrio, chamado de disbiose, pode aparecer problemas de saúde como maior suscetibilidade a infecções.

O trato gastrointestinal humano possui cerca de 100 trilhões de microrganismos sendo o local orgânico mais densamente povoado por micro-organismos.

A microbiota humano estabelece no início da vida (no parto) sofrendo alterações desde o nascimento (idade gestacional, tipo de parto - parto vaginal ou parto cesariano) e ao longo da vida, influenciado por fatores como idade, uso de antibióticos, alimentação, localização geográfica, o e fatores ambientais.

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A morfologia das bactérias é dividida de diferentes formas, como esféricas (cocos), em bastonetes (bacilos), ou espiraladas (espirilos).

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Primeiramente, para falarmos de microbiota humana,  precisamos entender o que são bactérias. 

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Bactérias são microrganismos unicelulares, bastante abundantes e diversas. Elas são procariontes, ou seja, não possui núcleo dentro da célula e seu material genético fica disperso no citoplasma. As bactérias estão presentes em grande parte dos ambientes do planeta, se relacionando e influenciando nas demais formas de vida.

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Ausência ou quantidade muito baixa de bactérias: caso a pele esteja saudável, pode não haver uma quantidade significativa de bactérias visíveis ou podem aparecer poucas e dispersas na coloração de Gram.

A presença de cocos (estafilococos e estreptococos).

Caso a pele esteja com infecção na barreira cutânea, pode está associado a presença de staphylococcus aureus.

• caso a pele esteja com a sua microbiota regulada é possível que encontraremos a presença de algumas bactérias que são naturalmente comuns e benéficas para o organismo e sistema imunológico como Corynebacterium, staphylococcus aureus.

Bactérias gram-positivas.

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📌 1. Coletor de amostras:

Gilvan de Magalhães.

📌 2. Realizador da coloração de Gram: Ewertonn Soares.

📌 3. Microscopista:

Maiarah de vasconcelos.

📌 4. Cronometrista:

Guilherme Alves

📌 5. Relator digital:

Joane karine Carvalho

📌 6. Apresentador:

Enzo Leite e Ewertonn Soares

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Antony Monteiro, Enzo Leite, Ewertonn Soares, Guilherme Alves, Gilvan de Magalhães, Joane Karine, Maiarah de Vasconcelos.