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                                                                                                                      APLICACIONES DE LA PCR

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                                                                                                                      APLICACIONES DE LA PCR

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Proporcionado a los forenses criminales herramientas lo suficientemente poderosas para identificar individuos a partir de ADN residual en evidencia de la escena del crimen tan pequeña como colillas de cigarrillos, huellas dactilares manchadas o un solo cabello

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Durante una clonación dirigida por PCR de un gen o región de interés, los desajustes planificados en la secuencia del cebador y los T s ligeramente reducidos pueden usarse para introducir mutaciones deseadas en un proceso llamado mutagénesis dirigida al sitio

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Descubrimiento de nuevas especies de virus, cuando se emplean cebadores que coinciden con una especie de virus similar.

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tiene aplicaciones útiles, como en la búsqueda de una muestra de una secuencia desconocida que se sospecha que es similar a una conocida

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Los biólogos evolutivos han hecho uso de la PCR para amplificar el ADN de muestras bien conservadas, como insectos encerrados en ámbar de millones de años, con secuenciación posterior y análisis filogenético, obteniendo resultados fascinantes sobre la continuidad y evolución de la vida en la Tierra.

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Las aplicaciones del proceso de PCR son increíblemente diversas. La simple aparición o no aparición de un amplicón en una reacción adecuadamente controlada puede tomarse como evidencia de la presencia o ausencia, respectivamente, de la plantilla diana del ensayo. Esto conduce a aplicaciones médicas como la detección de agentes de enfermedades infecciosas a sensibilidades, especificidades y velocidades mucho mayores que los métodos alternativos.

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Colocando los fluoróforos informadores y desactivadores en sondas de ácido nucleico monocatenarias complementarias al amplicón esperado, se pueden diseñar diferentes variaciones de este método de modo que la aparición de FRET pueda usarse para monitorizar la producción de amplicones específicos de secuencia.

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Si el informador y el extintor no están colocalizados, la estimulación del informador conduce en cambio a la detección de luz en la frecuencia de emisión del informador.

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La transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET) ocurre solo cuando los fluoróforos informador y extintor están muy cerca uno del otro, lo que lleva a la detección de luz en el extintor.

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Varios enfoques alternativos utilizan reporteros de fluorescencia basados en sondas, que evitan esta posible señal inespecífica. Los enfoques basados en sondas funcionan mediante la aplicación de un proceso llamado transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET). En términos simples, FRET ocurre cuando dos fluoróforos están muy próximos y la longitud de onda de emisión de uno (el informador) coincide con la longitud de onda de excitación del otro (el extintor). Los fotones emitidos en la longitud de onda de emisión del tinte informador son capturados efectivamente por el tinte apagador cercano y reemitidos a la longitud de onda de emisión del apagador.

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Un problema potencial con este enfoque es que los tintes indicadores no son específicos de secuencia, por lo que cualquier producto espurio producido por la reacción puede dar lugar a señales positivas falsas.

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Conceptualmente, el método más simple para la detección de PCR en tiempo real se basa en el uso de tintes que se unen selectivamente y se vuelven fluorescentes en presencia de ADN de doble hebra, como SYBR green. La producción de un producto de PCR durante el termociclado conduce a un aumento exponencial en la cantidad de producto bicatenario presente en los pasos térmicos de recocido y extensión de cada ciclo.

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Estos, a su vez, utilizan una variedad de métodos para el marcado de amplicones, que incluyen quimioluminiscencia, fluorescencia y técnicas electroquímicas. Alternativamente,
las metodologías de PCR en tiempo real emplean alguna forma de detectar directamente la producción en curso de amplicones en el recipiente de reacción, más comúnmente mediante el monitoreo de un cambio de fluorescencia directo o indirecto relacionado con la producción de amplicones por métodos ópticos. Estos métodos permiten que el recipiente de reacción permanezca sellado durante todo el proceso.

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La
hibridación de productos de PCR en microarrays o arreglos de perlas en
suspensión se puede usar para detectar amplicones específicos cuando más de
una secuencia de producto puede salir de un ensayo.

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La detección de productos de PCR se puede realizar de varias formas. Las “técnicas de punto final” posteriores a la reacción incluyen electroforesis en gel y tinción con colorante específico de ADN.

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El emparejamiento de la PCR con un paso preliminar de transcripción inversa (ya sea con cebado aleatorio o usando uno de los cebadores de PCR para dirigir la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN [transcriptasa inversa]) permite que las plantillas de ARN se conviertan en ADNc y luego se sometan a una PCR regular , en una variación conocida como PCR de transcripción inversa (RT-PCR). En general, la discusión posterior utiliza el término PCR para referirse tanto a la PCR como a la RT-PCR.

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Se pueden emplear técnicas de “arranque en caliente”, frecuentemente a través de la modificación covalente de la polimerasa, para asegurar que no ocurra un apareamiento y extensión de cebadores inadecuados antes del primer paso de desnaturalización, evitando así la producción de productos incorrectos.

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En general, el proceso de PCR funciona mejor cuando los cebadores están a distancias cortas entre sí (de 100 a 500 pares de bases), pero las reacciones bien optimizadas han tenido éxito a distancias de decenas de kilobases.

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Quizás no sea sorprendente que haya muchas complejidades técnicas detrás de esta descripción engañosamente simple. El diseño del cebador debe tener en cuenta aspectos como las estructuras secundarias del ADN, la singularidad de la secuencia y la similitud de T entre los cebadores.

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Dentro de los 40 ciclos térmicos de una reacción de PCR idealizada, una única molécula de ADN molde genera aproximadamente 10 amplicones, más que suficiente para pasar de un objetivo invisible a un producto teñido con colorante fluorescente claramente visible.

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La repetición de los pasos térmicos de desnaturalización, hibridación y extensión del cebador conduce a una norte aumento exponencial ( donde norte es el número de ciclos térmicos) en el número de este producto definido, lo que permite niveles fenomenales de "amplificación de secuencia".

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Elevar la temperatura de nuevo a la desnaturalización detiene el proceso de elongación del cebador y desplaza las polimerasas y las hebras recién creadas. A medida que el sistema se enfría de nuevo a la temperatura de hibridación, cada una de las hebras de ADN simples y cortas recién formadas sirve como sitio de hibridación para su cebador de polaridad opuesta.

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La desnaturalización y el recocido ocurren como se describió anteriormente, pero con ambos cebadores. Si se permite que la extensión de la polimerasa continúe durante un corto período de tiempo (del orden de 1 minuto por 1000 pares de bases), cada uno de los cebadores se extenderá más allá de la ubicación del otro, creando así un nuevo sitio de apareamiento complementario para el cebador opuesto.

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El ingenio de la PCR surge de incorporar simultáneamente un segundo cebador cercano de polaridad opuesta (es decir, complementario a la hebra opuesta a la que se hibrida el primer cebador) y luego someter la mezcla de molde, dos cebadores (a altas concentraciones), ADN polimerasa termoestable, y tampón de polimerasa que contiene dNTP para ciclos repetidos de desnaturalización térmica, hibridación y extensión del cebador.

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La desnaturalización a 100 ° C en un tampón apropiado y enfriamiento rápido  de una molécula de plantilla de ADN en presencia de un exceso de cebador permite que el cebadores hibride con cualquier región de secuencia complementaria de la plantilla. Esto proporciona un sustrato para la acción de la polimerasa y la extensión del cebador, creando una copia complementaria de una hebra plantilla aguas abajo del cebador. 

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La desnaturalización a 100 ° C en un tampón apropiado y enfriamiento rápido  de una molécula de plantilla de ADN en presencia de un exceso de cebador permite que el cebadores hibride con cualquier región de secuencia complementaria de la plantilla. Esto proporciona un sustrato para la acción de la polimerasa y la extensión del cebador, creando una copia complementaria de una hebra plantilla aguas abajo del cebador. 

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Los conceptos son simples y se basan en el conocimiento de que las ADN polimerasas requieren una hebra molde con un cebador hibridado que contiene un hidroxilo 3' para comenzar la extensión de la hebra. 

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Los conceptos son simples y se basan en el conocimiento de que las ADN polimerasas requieren una hebra molde con un cebador hibridado que contiene un hidroxilo 3' para comenzar la extensión de la hebra. 

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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 🧬

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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 🧬

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Existe evidencia de que los principios básicos del método de la PCR fueron comprendidos y utilizados en la práctica por algunas personas en 1983, pero el crédito por la conceptualización  y la previsión de sus aplicaciones recae en Kary Mullis, a quien se le otorgó el premio Nobel de Química de 1993 por su conocimiento.