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La Fertilización In Vitro es la Técnica de Reproducción Asistida  en donde la Maduración y Fecundación de los gametos  femeninos, así como  el desarrollo  de  los  embriones resultantes hasta el estado de blastocisto, se  lleva  a  cabo artificialmente a nivel de laboratorio, para con posterioridad ser congelados o transferidos a una receptora en donde terminará su período de gestación, dando lugar a un nuevo individuo viable. Surgió hace 40 años, desde la aplicación de la técnica en especies de producción hasta nuestros tiempos donde la producción comercial a larga escala se da, con resultados importantes para la mejora continua de las producciones pecuarias.
La primera cría en bovinos obtenida por FIV fue un ternero  nacido el 9-06-1981.

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La vitrificación es una técnica de congelación ultrarrápida basada en el contacto directo entre la solución de vitrificación que contiene los agentes crioprotectores con las células y el nitrógeno líquido, que al ser enfriados no cristalizan, sino que se torna viscosa y pasa del estado líquido al sólido no estructurado similar al vidrio, tomando de allí su nombre.
El interés en la criopreservación del ovocito ha aumentado con la creciente importancia en la producción de embriones in vitro.

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Para descongelar los ovocitos, las microgotas vitrificadas se retiraron del vial criogénico y se expusieron a una solución de 2 ml de TRE 0,3 M en SB por 5 minutos sobre una platina temperada a 39 ºC y luego los ovocitos se transfirieron a SB por un tiempo no menor de 2 minutos. Los ovocitos se lavaron tres veces en mSOF-Hepes y se colocaron en medio de maduración fresco por 30 minutos. De este modo, desde el descongelamiento hasta la activación química transcurrieron aproximadamente 50-60 minutos.

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Se formaron tres grupos experimentales de ovocitos expuestos a la activación química:

I) ovocitos vitrificados sobrevivientes a la criopreservación, II) ovocitos expuestos a las soluciones vitrificantes (control de toxicidad de los crioprotectantes) y III) grupo control de ovocitos no expuestos a las soluciones vitrificantes.

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Los ovocitos maduros libres de células del cumulus se suspendieron en un medio de equilibrio (SVI) consistente de 4% etilenglicol (EG, Sigma) diluido en una solución base.Brevemente, los ovocitos se cultivaron en mSOF-Hepes conteniendo 5 μM de ionomicina de Ca (Sigma) por 4 minutos a 39 °C e inmediatamente después cultivados en gotas de 100 μl de mSOF-IVC suplementado con 3 mg/ml de BSA, 2 mM de 6-dimetilaminopurina (6-DMAP, Sigma) y 12,5 μM de citocalasina B (Sigma) por 5 horas en atmósfera húmeda con 5% CO2 al aire a 38,5 ºC.

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Concluidos los tratamientos para la activación artificial, los ovocitos se cultivaron de acuerdo a Martínez y col (2007) por 8-9 días en gotas de 40 μl de mSOF suplementado con 3 mg/ml de BSA en estufa de cultivo a 38,5 ºC en atmósfera húmeda con 5% de CO2 al aire. Se evaluó, con la ayuda de un microscopio invertido (Diaphot, Nikon, Tokyo, Japan) con aumento de 10x, la tasa de segmentación a los dos días y la tasa de blastocistos obtenidos a los ocho días de desarrollo posactivación química de los ovocitos.

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Objetivo de la activación química en ovocitos

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Objetivo de la activación química en ovocitos

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La activación química de ovocitos se realiza con el objetivo de imitar en el ovocito los efectos que desencadena la penetración del espermatozoide para estimular el desarrollo de un embrión in vitro. Por ello, esta técnica se utiliza para estimular ovocitos en la producción de embriones partenogenéticos; para activar embriones producidos por inyección intracitoplasmática de esperma-tozoides (ICSI), por transferencia nuclear (clonación) o transgénesis.

Además es una buena herramienta para evaluar la calidad de los ovocitos madurados in vitro, para evaluar la calidad de ovocitos vitrificados/descongelados, para identificar un protocolo óptimo para la activación del ovocito necesaria en la clonación por transferencia nuclear o para el estudio citogenético de embriones.

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Diferencias morfo y fisiológicas entre embriones producidos In vitro y embriones obtenidos In vivo

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Diferencias morfo y fisiológicas entre embriones producidos In vitro y embriones obtenidos In vivo

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Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los obtenidos in vivo, existiendo entre ellos numerosas diferencias. Los embriones producidos in vitro son más oscuros y de menor densidad por su mayor contenido citoplasmático de lípidos. Tienen un menor número de blastómeras, en especial  a nivel de la masa celular interna, una zona pelúcida más frágil, reducción del espacio perivitelino y mayor velocidad de desarrollo.

Los embriones producidos in vitro presentan alteraciones de comunicación intercelular, con una expresión anormal de las proteínas que forman las uniones Gap, un mayor contenido de triglicéridos y menor de otros lípidos, alteraciones de la expresión genética, mayor incidencia de apoptosis. Lo anterior reduce su potencial de desarrollo pre y postimplantación, lo cual origina porcentajes de gestación  de 30-40%.

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Se realiza generalmente en base a tres criterios: el diámetro del ovocito, el aspecto de su citoplasma y las características del cúmulo que los rodea. El diámetro de los ovocitos condiciona su capacidad para madurar  de tal forma que los ovocitos bovinos con un diámetro inferior a 110 μm se encuentran todavía en fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad para madurar.

Los ovocitos rodeados por un cúmulo compacto formado por varias capas de células, presentan mayores porcentajes de maduración, fecundación y desarrollo hasta blastocistos, que los que carecen de cúmulo o los que están rodeados solamente por la corona radiada.

Según Ruíz, Correa y Martínez (2010), es posible obtener ovocitos bovinos morfológicamente normales luego de la vitrificación/descongelación. La exposición de ovocitos a la solución de vitrificación no mostró reducción en la tasa de segmentación y desarrollo de blastocistos partenogenéticos.