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Se utilizaron dos tipos de colorantes de metales pesados para teñir los cromosomas en las ventanas de nitruro de silicio.

El azul de platino se sintetizó en el laboratorio y se aplicó a las muestras de cromosomas, eliminando el exceso de colorante y dejándolo secar.

El acetato de uranilo se preparó a partir de una solución madre y se tiñeron las rejillas con una gota de esta solución, secándolas después de cada lavado y tinción.

Las muestras teñidas se almacenaron antes de obtener imágenes de rayos X. Para cargar los cromosomas en los portamuestras, se utilizó un soporte de rejilla único o impreso en 3D, asegurando las rejillas con la tapa del soporte.

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Imágenes de cromosomas por ptycografía de rayos X

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Imágenes de cromosomas por ptycografía de rayos X

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Los cambios de fase registrados en las imágenes indicaron la densidad de electrones del material cromosómico.

Los valores de fase promedio en el segundo experimento fueron un orden de magnitud más altos que en el primer experimento.

La discrepancia se atribuyó a un posible retraso de 5 a 6 meses entre la preparación de la muestra y la medición en el primer experimento, lo que pudo haber resultado en la pérdida de parte de la masa cromosómica durante el almacenamiento.

Los valores cuantitativos del segundo experimento, con muestras más recientes, se consideran más confiables.

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Determination of masses from the chromosome reconstructions

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Determination of masses from the chromosome reconstructions

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Para calcular la masa de los cromosomas individuales, se requirió de las imágenes de fase obtenidas mediante ptychography.

El conocimiento de las masas individuales permite generar un cariotipo de rayos X completamente cuantitativo clasificándolos en el orden de su número de cromosomas.

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Investigar la cantidad de proteína (histona y no histona) presente en cada cromosoma metafásico individual a partir de las masas obtenidas utilizando el nuevo método de imagen de la pticografía de rayos X

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La masa de los cromosomas aumenta con la irradiación a dosis bajas (0,1 Gy)  en comparación con dosis más altas.

Se cree que la irradiación a dosis bajas puede tener efectos herméticos.

La técnica de pticografía de rayos X permite medir las masas de los cromosomas humanos.

Esta técnica es especialmente útil ya que nos brinda información detallada sobre la estructura de los cromosomas y su composición molecular.

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1. Masa de histonas por nucleosoma
2. Masa de proteínas no histonas por nucleosoma
3. Masa del ADN unido
Con esta suma (en Da) se puede estimar la masa de un cromosoma.

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Esta funciona escaneando patrones de dispersión superpuestos de una muestra de material y buscando cambios en la región superpuesta.
Mide los desplazamientos de fase en unidades de densidad electrónica, por tanto con los electrones de cada cromosoma aislado, se puede calcular la masa.

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Se usó un acelerador de partículas para producir un potente haz de rayos X. Cuando estos atraviesan los cromosomas, su difracción crea un patrón de interferencia que los especialistas utilizaron para crear una reconstrucción 3D de alta resolución de ese cromosoma.

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Se describe cómo intentaron mejorar el contraste de fase de los cromosomas humanos utilizando una técnica de tinción con acetato de uranilo y azul de platino.

Los cromosomas teñidos son aproximadamente 2 a 3 veces más pesados ​​en sus masas medidas.

Los metales agregan hasta un 100 % de masa adicional.

Acetato de uranilo es radioactivo y es tóxico para muestras biológicas, lo que perturba las interacciones de proteína-proteína/ ADN-proteína.

Azul de platino es menos tóxica y buen sustituto de uranilo.

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Montaje experimental para pticografía de rayos X

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Montaje experimental para pticografía de rayos X

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El beamline I13 (Línea de luz I13) es una instalación de investigación en Diamond Light Source, que es el acelerador de sincrotrón del Reino Unido.

El procedimiento consta de los siguientes pasos:

1. Filtrado del haz de rayos X

2. Enfoque del haz de rayos X

3. Selección del orden de difracción

4. Eliminación del haz de orden cero

5. Colocación de la muestra

6. Reducción de la dispersión del aire

7. Registro del patrón de difracción

8. Procesamiento de los datos

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Se realizó un análisis estadístico limitado debido a las restricciones temporales, pero se pudo evaluar la reproducibilidad de los pasos clave en la determinación de la masa cromosómica.

Se observaron cambios menores en la asignación de números de cromosomas, pero no se encontró una pérdida significativa de masa debido a la exposición a rayos X.

Se identificaron distribuciones de masa reproducibles, con una tendencia hacia mayores valores en la media en comparación con la mediana, con algunas excepciones en niveles de irradiación más altos.

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Sorprendentemente, la masa total para 0,1 Gy es mayor que la de los cromosomas no irradiados, luego disminuye significativamente para 0,5 Gy antes de aumentar nuevamente para 1 Gy.

Se observó que la masa promedio del cromosoma 1 es mucho mayor de lo esperado en comparación con los otros cromosomas, tanto en las muestras no irradiadas como en las irradiadas. Esto puede indicar una subestimación del componente proteico asociado o la presencia de otras moléculas originadas en el citoplasma durante la preparación de las muestras.

El estudio también analizó los efectos de la radiación ionizante en el contenido de masa de los cromosomas en diferentes etapas del ciclo celular. Se identificaron diversas proteínas asociadas con la replicación y condensación de los cromosomas en diferentes fases del ciclo celular. Se observó que las masas medidas de los cromosomas variaron con las dosis de radiación, posiblemente debido a lesiones en el ADN y modificaciones de las proteínas.

Además, se encontró que las células T mostraban una respuesta de reparación del ADN después de la irradiación, lo que podría explicar el aumento en la masa de los cromosomas irradiados. Sin embargo, la disminución en la masa observada a 0,5 Gy no se puede explicar fácilmente y requiere una mayor investigación.

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Effect of radiation exposure during imaging

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Effect of radiation exposure during imaging

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Se midieron las masas cuantitativas para diferentes tiempos de exposición utilizados en la técnica de ptychography de rayos X. Se utilizaron cromosomas metafásicos humanos fijados en metanol y ácido acético (3:1) obtenidos de linfocitos T primarios. Se realizaron escaneos de los cromosomas irradiados (0.1 Gy, 0.5 Gy y 1 Gy) y no irradiados (control) para tres tiempos de exposición de imagen diferentes: 0.3 s, 0.6 s y 0.9 s.

En la Figura 8 se presentan las masas de 22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales (XX). Cada masa de cromosoma es el promedio de dos cromosomas homólogos. El gráfico muestra las masas registradas como puntos de datos en forma de estrella. La caja sombreada rectangular muestra la distribución del 50% de los puntos de datos de masa, los bigotes superior e inferior representan los valores máximos y mínimos, respectivamente, y la línea horizontal y la caja pequeña dentro de la caja grande representan la mediana y el valor promedio de cada distribución, respectivamente.

Se observó una disminución en las masas medidas con el aumento del tiempo de exposición, lo cual se observó también en las irradiaciones de 0.1 Gy y 1 Gy. Las masas sumadas para la irradiación de 0.1 Gy fueron de 336.5 pg, 298.7 pg y 250.7 pg para 0.3 s, 0.6 s y 0.9 s, mientras que para 1 Gy fueron de 293.1 pg, 256.5 pg y 259.7 pg, respectivamente. Sin embargo, las masas sumadas a una dosis de 0.5 Gy fueron de 172.9 pg, 203.4 pg y 193.4 pg para 0.3 s, 0.6 s y 0.9 s, lo que sugiere una tendencia creciente. Se observó un aumento significativo en las masas medidas a 0.1 Gy y 1 Gy en comparación con la muestra de control no irradiada en todos los tiempos de exposición, lo que respalda la hipótesis de la activación inmediata de respuestas del ciclo celular y la activación de vías de señalización de proteínas de reparación del ADN, lo cual agrega masa a los cromosomas irradiados.